NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
- Thời gian: Từ tháng 6/2019 đến tháng 6/2020;
- Địa điểm: Trung tâm kiểm nghiệm dược và sinh phẩm Công ty TNHH
Dược Hanvet-KCN Phố Nối A - Mỹ Hòa - Hưng Yên.
NGUYÊN LIỆU
3.3.1 Virus PED dùng trong nghiên cứu
Virus PED được phân lập từ 4 mẫu PEDV, thu thập từ bệnh phẩm của lợn con theo mẹ mắc tiêu chảy cấp tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2016-2018 Những mẫu bệnh phẩm này được nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Công ty.
Hanvet cung cấp virus được chia nhỏ vào ống Eppendorf và bảo quản ở nhiệt độ -80°C, coi đây là virus gốc phục vụ cho nghiên cứu Các mẫu virus này được giám định trong quá trình nghiên cứu để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả.
- Vắc xin PED nhược độc nhập khẩu, lấy mẫu trên thị trường tháng 6 năm
Vắc xin nhược độc đông khô sản xuất vào tháng 01 năm 2019 có hạn sử dụng đến tháng 06 năm 2021 và cần được bảo quản ở nhiệt độ từ 4-8 độ C Virus trong vắc xin này thuộc genogroup 1b của PEDV, đã được xác định qua nghiên cứu genogroup.
3.3.2 Hóa chất, sinh phẩm trong nghiên cứu
Huyết thanh lợn và sữa đầu lợn nái, bao gồm huyết thanh lợn nái và huyết thanh lợn con theo mẹ, được thu mẫu từ các trại âm tính và dương tính với virus PEDV Những mẫu này được sử dụng để so sánh kết quả giữa hai phương pháp ELISA và phản ứng trung hòa mới được xây dựng Trại dương tính và âm tính được xác định thông qua xét nghiệm ELISA huyết thanh, trong khi phân lợn con bị tiêu chảy được xác định bằng phương pháp RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho PEDV.
- Mẫu huyết thanh lợn tối miễn dịch kháng nguyên PEDV thực địa được tạo mẫu chuẩn dương phòng thí nghiệm gọi tắt mẫu chuẩn QC (+);
- Mẫu huyết thanh lợn không có kháng thể kháng PEDV được xác định bằng ELISA và phản ứng trung hòa, gọi tắt mẫu chuẩn QC (-);
- Dòng tế bào Vero (ATCC - CCL-81);
- Môi trường: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM- Gibco), huyết thanh bào thai bò (FBS-Gibco); Tryptose Phosphate Broth (TBP-Merck); Yeast extract (YE-Merck); Trypsin 1: 250 (Gibco);
- Sinh phẩm, hóa chất dùng nhuộm IPMA: anti- PEDV monoclonal antibody (Median Diagnostics Inc), HRP- conjugated goat anti- mouse IgG (US
Biological); N, N-Dimethylformamide (Sigma); cơ chất 3-amino-9- ethylcarbazole (AEC- Sigma);
- Kít tách ARN (Patho Gene-spin DNA/RNA extraction kit, iNtRON 17154);
The study utilized a cDNA synthesis kit (MMLV reverse transcriptase, Promega, M1705) and a PCR kit (GoTaq G2 Hot Start Master, Promega, M7423) along with specific primers for detecting PEDV genogroups, TGEV, and Rotavirus, based on previous research (Song et al., 2006; Zhao et al., 2014).
- Nghiên cứu dùng đối chứng dương ARN- PEDV dùng trong phản ứng
RT- PCR: vắc xin PEDV nhược độc công ty Deasung Hàn Quốc;
- Vắc xin kép chứa TGEV và Rotavirus ProSystem 2143 (Intervet) làm đối chứng dương ARN TGEV và Rotavirus;
- Thang ADN chuẩn:100 bp (hãng Cleverscientific), đối chứng dương chuẩn của Rotavirus và TGEV (vắc xin Prosysterm, Merck Animal Health)
- Bộ ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể PEDV (Swinecheck PED indirect- TRM-558, Biovet);
- Bộ phản ứng ELISA (được thiết lập theo tiêu chuẩn cơ sở) phát hiện kháng thể kháng protein S của PEDV
3.3.3 Vật tư và thiết bị
- Các loại chai T-flask, đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning cung cấp);
- Các loại Pippete, các loại đầu côn (Ependorf cung cấp);
- Kính hiển vi soi ngược (Olympus);
- Máy PCR (Proflex PCR- Applied Biosysterms);
- Bộ điện di và đọc kết quả PCR
Hình 3.1 Hóa chất, sinh phẩm nghiên cứu
Hình 3.2 Thiết bị và phòng thí nghiệm đạt chuẩn GLP
N Ộ I DUNG
3.4.1 Lựa chọn chủng PEDV dùngtrong nghiên cứu
- Xác định đặc tính sinh học và hiệu giá virus;
- Giám định tính thuần khiết của chủng PEDV;
- Xác định độc lực của chủng PEDV thực địa
3.4.2 Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa
- Kết quả tối ưu môi trường dùng trong phản ứng trung hòa;
- Tối ưu cách đánh giá kết quả của phản ứng trung hòa
3.4.3 Xác định giá trị sử dụng phản ứng trung hòa
- Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu trên nền mẫu thực địa
- Độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hòa trên nền mẫu chuẩn QC
- Phản ứng trung hòa xác định kháng thể ở huyết thanh và sữa đầu
3 4.4 Đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa các chủng
- Chế huyết thanh thỏ kháng các chủng PEDV thực địa
- Đánh giá khả năng trung hòa chéo giữa các chủng PEDV
+ Khả năng trung hòa các chủng virus của huyết thanh kháng PEDV 0118 + Kết quả hiệu giá kháng thể trung hòa chéo giữa các chủng PEDV
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
- Tách chiết ARN tổng số được bằng Patho Gene-spin DNA/RNA extraction kit, iNtRON 17154, các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất;
- ARN sau khi tách chiết được tổng hợp cDNA bằng kít tổng hợp cDNA (Maxime™ RT PreMix (Random Primer), iNtRON, 25082);
The PCR reaction utilized GoTaq® G2 Master Mixes (Promega, M7822) along with specific primers P1/P2 for the PEDV S gene, T1/T2 for TGEV detection, and rot3/rot5 for Rotavirus identification, as detailed in Table 3.1 Positive controls included the TGEV strain and Rotavirus serotype A, as well as the ProSystem 2143 vaccine (Intervet), with procedures following previously described methods (Song et al., 2006; Sun et al., 2014).
Bảng 3.1 Trình tự mồi của virus PEDV, TGEV, Rotavirus
TT Tên mồi Trình tự nucleotid 5’- 3’ Sản phẩm Ghi chú
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,2% trong thời gian 30 phút Sau khi điện di, gel được nhuộm bằng Red gel trong 5 - 6 phút và sau đó quan sát dưới tia UV Kết quả điện di cho thấy DNA xuất hiện dưới dạng những vệt phát sáng Kết quả được coi là dương tính khi kích thước sản phẩm DNA phù hợp với thiết kế mồi theo Bảng 3.1, trong khi mẫu âm tính sẽ không có vệt phát sáng, biểu thị không có sản phẩm DNA.
3.5.2 Phương pháp giám định genogroup của PEDV Để phân biệt PEDV dòng cổ điển (genogroup G1) và PEDV dòng mới nổi (genogroup G2) nghiên cứu xác định genogroup bằng phản ứng multiplex RT- PCR Cặp mồi sử dụng được chọn theo công bố trước đây phương pháp (Zhao & cs., 2014) với trình tự được trình bày ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Trình tự mồi đặc hiệu genogroup PEDV Tên mồi Trình tự nucleotide 5’- 3’
Bảng 3.3 Cách kết hợp mồi xác định genogroup PEDV
Mục đích Kết hợp mồi Kích thước sản phẩm Đặc hiệu chung PEDV PED.Zhao.840F/
PED.Zhao.840R 817 bp Đặc hiệu genogroup G1 PED.F-Probe-C/
PED.Zhao.840R 685 bp Đặc hiệu genogroup G2 PED.F-Probe-V/
Cách đọc kết quả phản ứng multiplex RT-PCR như sau: cặp mồi
PED.Zhao.840F/ PED.Zhao.840R chung cho genogroup G1 và genogroup G2, nên tất cả các mẫu dương tính PEDV thì đều có băng sản phẩm có kích thước
If PEDV belongs to genogroup G1, a product band of 817 bp will be observed along with an additional band of 685 bp (PED.F-Probe-C/PED.Zhao.840R) Conversely, if PEDV is classified under genogroup G2, a product band measuring 669 bp will appear (PED.F-Probe-V/PED.Zhao.840R).
3.5.3 Phương pháp thử độc lực của PEDV trên lợn con theo mẹ
Bố trí thí nghiệm nhằm xác định độc lực của chủng PEDV 0118 đã được thực hiện qua 06 đời lợn con sơ sinh 1 ngày tuổi, nuôi bằng sữa chuyên dụng (Nutrilac ® - Joosten) trong điều kiện không bú sữa mẹ Khi lợn 2 ngày tuổi, tiến hành kiểm tra kháng thể PEDV trong huyết thanh bằng phản ứng Elisa, đồng thời kiểm tra virus trong phân Nếu huyết thanh âm tính với kháng thể chống PEDV và mẫu phân cho kết quả âm tính với RT-PCR đối với PEDV, Rotavirus và TGEV, sẽ tiến hành xác định độc lực của chủng PEDV 0118 bằng cách chia lợn thành 2 nhóm.
- Nhóm đối chứng 05 con: cho uống 5ml sữa/ con, không chứa virus;
- Nhóm thí nghiệm 05 con: gây nhiễm bằng đường uống bởi 1ml hỗn dịch virus chứa 10 4.0 TCID50/ml trộn 5ml sữa
Nuôi cách ly nghiêm ngặt ở 2 ô chuồng khác nhau.Theo dõi lợn sau gây nhiễm các biểu hiện:
+ (1) Thể trạng lâm sàng: tình trạng tiêu chảy, nôn, mất nước, gầy, ăn uống, chết;
+ (2) Xét nghiệm virus thải trừ qua phân bằng RT-PCR;
+ (3) Mổ khám, quan sát bệnh tích: ruột, chất chứa trong ruột
3.5.4 Phương pháp xác định hiệu giá PEDV trên tế bào Vero
- Chuẩn bị tế bào Vero 1 lớp nuôi 24 giờ trên đĩa 96 giếng trong môi trường DMEM 5% FBS Thảm tế bào được rửa 3 lần bằng PBS 1x
Hỗn dịch virus cần được pha loãng liên tiếp theo cơ số 10 trong môi trường DMEM có bổ sung TBP 0,3%, YE 0,02% và trypsin 10 µg/ml Sau đó, chuyển hỗn dịch virus ở mỗi độ pha loãng vào 5 giếng tế bào và ủ ở 37°C với 5% CO2 trong điều kiện ẩm ướt trong vòng 24 giờ.
Cố định tế bào vào đĩa phản ứng bằng 50µl/giếng hỗn dịch PBS có bổ sung NP40 1% và 10% formalin Sau đó, loại bỏ hỗn dịch cố định bằng cách rửa đĩa 3 lần với PBS 1x.
- Thêm kháng thể đặc hiệu kháng PEDV (Anti- PEDV monoclone antibody) 50àl/giếng Rửa đĩa bằng PBS 1x
- Thờm 50àl/giếng khỏng thể cộng hợp HRP- conjugated goat anti- mouse IgG (US Biological) Rửa đĩa bằng PBS 1x
Thí nghiệm với 50 giếng cơ chất AEC cho thấy phản ứng quan sát qua kính hiển vi soi ngược: nguyên sinh chất của tế bào bắt màu đỏ (dương tính), trong khi nguyên sinh chất không bắt màu (âm tính) Hiệu giá virus (TCID50 - liều nhiễm 50% số giếng tế bào) được xác định theo công thức Spearman-Karber.
3.5.5 Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PEDV Để làm cơ sở tính độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng trung hòa, nghiên cứu này chọn phản ứng ELISA (phát hiện kháng thể lớp IgG) làm tham chiếu Kít ELISA đã thiết lập theo tiêu chuẩn cơ sở (ELISA cơ sở) được đánh giá độ nhạy/ đặc hiệu với kít ELISA thương mại SwinecheckPED indirect, Biovet (không trình bày) Các bước thực hiện tóm tắt như sau: chủng PEDV 0118 cường độc phủ đĩa ở hiệu giá 10 4,2 TCID50/ml trong coating buffer (pH = 9,6) ở 4 0 C trong 12 giờ; huyết thanh chẩn đoán được pha 1/200 trong sữa tách bơ 3% - PBS- Tween 20 0,05%; kháng thể kháng IgG lợn gắn enzyme được pha 1/1200 trong sữa tách bơ 3%- PBS- Tween 20 0,05% Giữa các bước, ủ ở nhiệt độ 37 0 C, trong vòng 60 phút; rửa 3 lần bằng dung dịch PBS- Tween 20 0,05% để loại bỏ các thành phần không đặc hiệu Mẫu có giá trị ngưỡng OD450 < 0,225 được xác định âm tính với kháng thể kháng PEDV
3.5.6 Phương pháp miễn dịch mỗi chủng PEDV trên thỏ
- Chọn thỏ thí nghiệm: thỏ khỏe mạnh, 3 tháng tuổi, nặng từ 1,6 đến 2kg Lấy máu trước tiêm kiểm tra kháng thể trung hòa PEDV cho kết quả âm tính;
- Bố trí nhóm thỏ thí nghiệm: 1 chủng virus được miễn dịch trên 3 thỏ;
- Nhóm đối chứng không tiêm Các nhóm thỏ được nuôi cách ly;
Virus chủng PED được cô đặc bằng PEG 6000 và kiểm tra hiệu giá virus của từng chủng PEDV Định liều miễn dịch cho các chủng PEDV là 10^5,5 TCID50/ml trước khi tiến hành vô hoạt bằng BEI (Banary ethyleneimine) Sau đó, quá trình gây nhũ được thực hiện bằng cách sử dụng bổ trợ ISA 201 (Seppic) để tạo ra hỗn dịch vắc xin dạng nhũ dầu.
- Miễn dịch thỏ, miễn dịch 3 mũi/1 chủng PEDV với liều tăng dần theo trình tự: 1ml/con, 2ml/con, 4ml/con, tiêm dưới da, mỗi mũi cách nhau 7 ngày;
- Lấy máu khảo sát kháng thể trung hòa PEDV định kỳ, D0, D7, D14, D21, D28, D35, D42 Thu hoạch máu thỏ tại D42 bằng đường động mạch cổ;
- Máu thỏ để đông tự nhiên, chắt huyết thanh, vô hoạt ở nhiệt độ 56 0 C/30 phút, kiểm tra vô trùng, chia huyết thanh vào ống Eppendorf, bảo quản -20 0 C
Huyết thanh mỗi nhóm thỏ được coi như huyết thanh chuẩn phòng thí nghiệm kháng mỗi chủng PEDV dùng nghiên cứu
3.5.7 Phương pháp thiết lập phản ứng trung hòa PEDV
Phương pháp trung hòa virus được thiết lập với sự điều chỉnh từ các tài liệu đã mô tả trước đây (Paudel & cs., 2014a; Collin & cs., 2015; Clement & cs.,
Phản ứng được thiết lập dựa trên huyết thanh lợn dương tính và âm tính với kháng thể kháng PEDV, được chọn từ bộ huyết thanh theo tiêu chuẩn cơ sở Huyết thanh được thu thập từ hai trang trại: một trang trại không có tiền sử bệnh tiêu chảy do virus và âm tính với PEDV, và một trang trại đã từng mắc PED, có kết quả dương tính với PEDV qua phương pháp RT-PCR Mẫu huyết thanh được bất hoạt ở 56°C trong 30 phút và được xác định dương tính hoặc âm tính với kháng thể kháng PEDV bằng phản ứng ELISA cơ sở.
Huyết thanh cần xác định hiệu giá kháng thể trung hòa bằng cách pha loãng liên tiếp theo tỷ lệ 2 Mỗi độ pha loãng sẽ được kết hợp với một thể tích virus cố định để đánh giá hiệu giá kháng thể.
100 TCID50/100àl) theo tỷ lệ 1:1 Ủ huyễn dịch huyết thanh: virus ở 37 0 C/ 5%
Trong quá trình thí nghiệm, CO2 được duy trì trong 1 giờ 30 phút Đầu tiên, chuyển 100 µl hỗn dịch huyết thanh chứa virus vào tế bào Vero đã được rửa 3 lần bằng PBS 1X Sau thời gian hấp phụ 1 giờ 30 phút, loại bỏ dịch huyết thanh và rửa tế bào 3 lần, sau đó thêm 100 µl DMEM có chứa TPB (0,3%), YE (0,02%) và trypsin (8 µg/ml).
Để xác định giếng có kháng thể trung hòa dương tính, phương pháp hóa miễn dịch được áp dụng, trong đó tế bào được cố định bằng dung dịch PBS chứa 10% formalin và 1% NP40 Sau đó, kháng thể đặc hiệu PEDV (kháng thể đơn dòng anti-PEDV - Median Diagnostics Inc.) được thêm vào, và sau khi rửa đĩa phản ứng, kháng thể cộng hợp (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG - US Biological) cùng với cơ chất AEC được bổ sung Tế bào nhiễm virus sẽ cho màu đỏ khi quan sát dưới kính hiển vi soi ngược Kết quả trung hòa được đánh giá dựa trên mức độ giảm 90% số tế bào/ số cụm tế bào nhiễm virus so với đối chứng âm Hiệu giá kháng thể trung hòa được xác định là số nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất mà vẫn cho kết quả dương tính, và mẫu được coi là dương tính khi có hiệu giá kháng thể trung hòa.
Theo nghiên cứu của Qi và cộng sự (2016), có 90% số lợn được khảo sát có hiệu giá kháng thể trung hòa đạt ≥ 20 Do đó, ngưỡng dương được xác định là hiệu giá kháng thể ≥ 20 (Collin và cộng sự, 2015; Qi và cộng sự, 2016).
3.5.8 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hòa virus
