Đề tài phân tích PhIP, MeIQx trong thực phẩm đã qua chế biến

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.2-1: Điểm bốc khói cân chất béo số loại dầu thực vật 11 Bảng 1.3-1: Nồng độ PhIP số thức ăn .16 Bảng 1.3-2: Hàm lượng MeIQx số ăn .18 Bảng 1.3-3: Hàm lượng PhIP MeIQx mẫu thịt bò nhiệt độ thời gian nấu khác 22 Bảng 1.3-4: Nồng độ PhIP MeIQx thịt bò chế biến phương pháp khác 23 Bảng 1.3-6: Nồng độ PhIP MeIQx thịt lợn chế biến phương pháp khác 25 Bảng 1.3-7: Nồng độ PhIP MeIQx ức gà chế biến phương pháp khác 26 Bảng 1.3-8: Nồng độ PhIP MeIQx cá chế biến phương pháp khác 26 Bảng 2.1-1 Đối tượng nghiên cứu .31 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.3.1: Một số cấu trúc HCAs 16 Hình 1.3.2: Công thức cấu tạo Trp-P-2 Glu -P-2 16 Hình 1.5.1: Quy trình xử lý mẫu bản của Takashi Sugimura (1998) 30 Hình 1.5.2: Quy trình xử lý mẫu của Takashi Sugimura (1998) .31 Hình 1.5.4: Quy trình xử lý mẫu của M.G Knize 32 Hình 1.5.5: Quy trình xử lý mẫu của Weijuan Ni cộng 33 Hình 2.3.1: Quy trình xử lý mẫu thực phẩm 40 Hình 3.2.1: Đường chuẩn PhIP sử dụng nội chuẩn 46 Hình 3.2.2: Đường chuẩn MeIQx sử dụng nội chuẩn 47 Đề tài: Phân tích PhIP, MeIQx thực phẩm qua chế biến Mở đầu Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng phương pháp phân tích HCAs đề phân tích PhIP MeIQx, - Sự tích lũy chúng trình chế biến thực phẩm phân tích hàm lượng mẫu thơi Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Xử lý mẫu thực phẩm Nội dung 2: Phân tích PhIP, MeIQx thực phẩm qua chế biến nhiệt độ cao phương pháp LC-MSn Viết lại bám vào mục tiêu CHƯƠNG 1.1 TỔNG QUAN Tình hình ung thư giới Việt Nam Theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế Thế giới WHO thì hiện thế giới có 23 triệu người mắc bệnh ung thư, 9.6 triệu người tử vong ung thư, 18.1 triệu trường hợp mới phát hiện (lúc 16:00 chiều ngày 12 tháng năm 2018 theo hệ thống) [15] Số người tử vong ung thư vào lúc 02:14 sáng ngày tháng năm 2018 theo hệ thống là 8.8 triệu người Vậy, số người tử vong ung thư đã tăng 800,000 người vòng tháng Số người chết ung thư chủ yếu tập trung ở các nước có thu nhập thấp và trung bình [2] Ở Việt Nam, 126,000 người mắc bệnh ung thư năm 2010, đến năm 2020, dự kiến sẽ 190,000 người mắc bệnh ung thư mới Năm 2018, Việt Nam có thêm 164,000 ca mắc ung thư mới và 114,000 người chết Việt Nam có thể trở thành một những quốc gia có tỷ lệ măc ung thư cao nhất thế giới PhIP gây khối u vú, đại tràng tuyến tiền liệt u lympho động vật thí nghiệm MeIQ gây ruột kết, gan, dày, da, tuyến vú khối u khoang miệng động vật thí nghiệm Mợt sớ bệnh ung thư gặp phổ biến là ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư đại tràng, ung thư cổ tử cung, v.v Ung thư vú là bệnh ung thư thường gặp nhất ở nữ, 14.000 mắc mới và 5.000 người tử vong Ung thư dạ dày có khoảng 12.000 người mắc mới và 8.000 người tử vong mỗi năm Năm 2010, ước tính toàn cầu có khoảng 754.000 người tử vong ung thư gan, ước tính trung bình mỗi năm có 10.000 ca ung thư gan mới phát hiện, tỷ lệ này cao nhất thế giới Năm 2018, bệnh nhân mắc mới ung thư gan là 25,335; chiếm 15.4% ca bệnh mắc ung thư ở Việt Nam năm 2018[4] Ung thư đại tràng, hằng năm có 8.768 ca mắc mới Ung thư ở Việt Nam có nhiều dạng bệnh và số trường hợp mắc phải là số đáng báo động [3] Có nhiều yếu tố dẫn đến nguy ung thư: chế độ ăn uống, hút thuốc lá, lối sống, di truyền, môi trường sống, v.v Tại Chương trình hoạt động giám sát của Quốc hội năm 2017 của Ủy ban Thường vụ Quốc hội, các chuyên gia lĩnh vực ung thư đánh giá tỷ lệ người mắc ung thư sử dụng thực phẩm chiếm tỷ lệ 35%, hút thuốc chiếm 30%, còn lại yếu tố di truyền khoảng 10% và một số nguyên nhân khác[3] Thực phẩm là nguyên nhân gây nên 1/3 trường hợp mắc bênh ung thư ở Việt Nam Tiến sĩ Ricardo Uauy- Viện trưởng Viện Dinh dưỡng Công nghệ Thực phẩm Đại học Chile-Giáo sư Dinh dưỡng Sức khỏe Cộng đồng Trường Vệ sinh Y học Nhiệt đới London đã tiến hành nghiên cứu và đưa nhận định chế độ ăn uống có ảnh hưởng đến nguy và tỷ lệ mắc bệnh mãn tính (ung thư, tim mạch, huyết áp, v.v.) Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có nghiên cứu cụ thể về chế độ ăn uống của người nhằm giảm nguy mắc ung thư Đây là một hướng nghiên cứu mới bệnh ung thư ở Việt Nam Tóm lai, bệnh ung thư đã, và ngày càng phát triển thế giới nói chung, Việt Nam nói riêng Các bệnh ung thư phổ biến là ung thư gan, ung thư vú, ung thư đại trực tràng Thực phẩm là nguyên nhân gây 1/3 trường hợp mắc ung thư ở Việt Nam Chế độ ăn, cách thức chế biến thực phẩm có ảnh hưởng đến nguy và tỷ lệ mắc bênh ung thư Nghiên cứu chế độ ăn và cách thức chế biến thực phẩm là hướng nghiên cứu mới nhằm giảm nguy mắc bệnh ung thư ở Việt Nam liên quan đến việc phân tích PhIP MeIQx 1.2 1.2.1 Văn hóa ăn uống người dân Việt Nam Ẩm thực qua thời kỳ Ẩm thực là cách gọi của phương thức chế biến món ăn, nguyên lý pha trộn gia vị và những thói quen ăn uống nói chung của người Song song với sự tiến hóa của loài người (Vượn người Người tối cổ Người cổ Người thông minh cổ Người hiện đại) ẩm thực ăn uống cũng thay đổi qua các giai đoạn tiến hóa Đầu tiên kể đến loài Vượn người, các loài vượn người đã biết bằng hai chân, có thể dùng công cụ thô sơ cành cây, hòn đá… chưa biết chế tác công cụ, chưa biết săn bắn nên thức ăn chuyên về rau, quả hái lượm rừng tự nhiên Vào năm 1979, nhà nhân chủng học Alan Walker đã nghiên cứu các bộ hóa thạch của vượn người không thấy men sứt mẻ, từ đó đưa kết luận loài này chủ yếu ăn thực vật mềm, thức ăn chủ yếu là trái cây, rau, quả và củ Trong đó, nhóm loài vượn người sống ở nơi khác cho kết quả men có nhiều vết trầy và sứt mẻ nên ông cho rằng loài này ngoài ăn trái cây, rau, quả và củ còn ăn một số loại hạt cứng Tóm lại, thức ăn chính của Vượn người là thực vật với hình thức ăn sống Người tối cổ Homo habilis được biết đến theo tên gọi “loài người khéo léo” đã tiến hóa cao vượn người về kích thước thể và não bộ; biết chế tác, dùng nhiều loại công cụ để thu hái hoa quả, củ tự nhiên; chưa biết dùng lửa và săn bắn nên thức ăn của họ chủ yếu là thực vật Tuy nhiên, một số nhóm người tối cổ ở Anh, Tây Ban Nha, đã chế tạo nhiều công cụ tinh vi để bắt cá, động vật nhỏ; chưa biết dùng lửa nên ăn theo hình thức gỏi sống Tóm lại người tối cổ đã biết chế tạo, sử dụng công cụ để phục vụ cuộc sống chưa biết dùng lửa nên thức ăn của họ chủ yếu là thực vật và một số nơi ăn thịt động vật sống Người cổ đó có loài người thông minh cổ (Homo sapiens) đã có kích thước thể, não bộ phát triển so với tổ tiên của họ chưa đạt mức giải phẫu người hiện đại Đa số biết dùng lửa, dùng công cụ khá tinh vi, biết săn bắn nên nguồn thức ăn từ thuần thực vật chuyển sang thêm ăn thịt, cá và có khuynh hướng chuyển sang động vật ăn tạp Thức ăn của người cổ chủ yếu là thực vật, đã có thêm động vật và hình thức ăn sống, nướng sơ qua để ăn chín Người thông minh cổ Homo sapiens đã có hành vi hiện đại của người gồm: có khả ngôn ngữ, có tư trừu tượng và phát triển tư trừu tượng, có khả sáng tạo và cải tiến khoa học kỹ thuật, có khả sản xuất và hoạt động xã hội Nhờ có hành vi hiện đại đó, loài người thông minh cổ chia phân loài mới là người thông minh hiện đại (Homo sapiens sapiens) Người thông minh hiện đại sống thành các nhóm du mục nhỏ, chuyển hóa dần từ hái lượm, săn bắt thành thuần hóa, nuôi động vật và trồng để thu hái Nền nông nghiệp đời Khi bắt đầu phát triển nền nông nghiệp, người bắt đầu thay đổi gần hoàn toàn những gì đã ăn trước Không chỉ còn ăn sống, nướng chín sơ qua để ăn trước, mà cách thức chế biến món ăn đã trở nên đa dạng theo thời gian, tùy vị trí và nền văn hóa Vậy, cùng với sự phát triển người (Vượn người Người tối cổ Người cổ Người thông minh cổ), văn hóa ăn uống có sự thay đổi từ ăn sống dần dần hình thành thói quen ăn chín, nhiên hình thức gia nhiệt làm chín ở vẫn chưa đa dạng, chủ yếu gia nhiệt bằng nước hoặc nướng với nhiệt độ trung bình (nướng sơ) Việt Nam là nước nông nghiệp vùng nhiệt đới gió mùa, nên ẩm thực Việt Nam vô cùng phong phú và đa dạng Ở thời Hùng Vương, món ăn đã có nhiều cách thức chế biến khác thực vật vẫn là nguyên liệu chính để chế biến những món ăn văn hóa Việt Nam Sách “Lĩnh Nam chích quái” trích: “…lấy cốt gạo làm rượu, lấy quang lang, lung tư làm cơm, lấy cầm thú, cá, ba ba làm mắm; lấy rễ gừng làm muối, cày bằng dao, trồng bằng lúa, sản xuất nhiều lúa nếp, lấy ống tre mà thổi cơm” Từ những nguyên liệu thiên nhiên, bằng tài và óc sáng tạo, tổ tiên ta còn làm loại đồ ăn khác là Bánh Chưng, Bánh Dày, Bánh tổ… Bên cạnh đó, thực phẩm có nguồn gốc động vật cũng được sử dụng Tuy nhiên về hình thức chế biến thực phẩm thì ngoài ăn sống, các món ăn vẫn được chế biến chủ yếu bằng cách hấp, luộc Để tăng thêm khẩu vị, người Việt đã tạo nước chấm đặc biệt có nguồn gốc từ động vật Nhìn chung ẩm thực Việt Nam đa dạng và phong phú Thực vật là nguyên liệu chính; hấp, luộc là cách thức chính để chế biến các món ăn Thế kỉ 18 đến 20, Thế chiến I và Thế chiến II có tác động rất lớn đền nền công nghiệp thực phẩm Những phát minh lớn về chế biến, bảo quản, lưu trữ và vận chuyển thức ăn xúc xích, mỳ tôm, trà túi lọc, thực phẩm đóng hộp… đã đời với các hình thức chế biến ở nhiệt độ cao là chủ yếu Để phục vụ thế chiến các nhà máy chăn nuôi công nghiệp cũng đã đời để cung cấp nguồn lương thực ổn định cho quân đội Kể từ đó đế thực phẩm đóng hộp chưa bao giờ ngừng phát triển Sau hai thế chiến, thực phẩm đóng hộp vẫn tiếp tục phát triển; các món ăn truyền thống đã được chế biến theo hình thức đóng gói, đóng hộp nhằm đưa các món ăn truyền thống ngoài, hội nhập thế giới Từ đó nhiều hình thức chế biến đã được hội nhập Để tăng tính cảm quan hoặc tăng thời gian bảo quản các hình thức chế biến ở nhiệt độ cao được sử dụng chủ yếu Tóm lại, từ thế kỉ 18 đến nay, thực phẩm chín (chủ yếu thịt động vật nuôi) chế biến ở nhiệt độ cao là những món ăn được ưa chuộng và thiết yếu bữa ăn của hầu hết mọi gia đình Nhìn chung, ẩm thực có sự thay đổi qua các giai đoạn tiến hóa của người thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Từ hình thức ăn sống; đến làm chín sản phẩm bằng hình thức luộc, hấp, nướng sơ (nhiệt độ gia nhiệt vừa phải); và đến hiện tại, thực phẩm có nguồn gốc từ thịt với hình thức chế biến ở nhiệt độ cao ngày càng được phát triển để tăng hương vị, cảm quan đồng thời tăng thời gian bảo quản cho sản phẩm 1.2.2 Sự thay đổi xu hướng ẩm thực Việt Nam ngày Ẩm thực của người Việt ngày rất đa dạng Người Việt vẫn giữ được nét tinh hoa ẩm thực các món ăn truyền thống như: Bún Chả, Phở, Nem cuộn, Bánh Chưng,v.v Ngoài ra, giao lưu văn hóa - một kết quả của quá trình hội nhập quốc tế – đã tạo nên sự dịch chuyển xu hướng ẩm thực của người dân Việt Nam Xu hướng ẩm thực người dân Việt Nam thay đổi theo nhu cầu thực phẩm từ đủ thực phẩm để dùng  thực phẩm ngon  thực phẩm sạch, ngon, tiện Hai phương pháp để làm chín thực phẩm phương pháp chế biến thực phẩm không sử dụng nhiệt phương pháp chế biến sử dụng nhiệt độ Trong đó, phương pháp chế biến không sử dụng nhiệt trộn dầu giấm, muối chua,v.v, khoảng thời gian để sử dụng cần có điều kiện đảm bảo an tồn vệ sinh nghiêm ngặt để sử dụng Mặt khác, phương pháp chế biến sử dụng nhiệt gồm làm chín nước; làm chín nước; làm chín cách gia nhiệt trực tiếp; làm chín chất béo yêu cầu thời gian chế biến ngắn mà đảm bảo vệ sinh thực phẩm Trong đó, nhờ phản ứng Maillard, thực phẩm gia nhiệt trực tiếp làm chín chất béo có màu sắc mùi vị kích thích giác quan người tiêu dùng so với thực phẩm làm chín nước nước Vì vậy, bữa ăn, xu hướng chọn thực phẩm chiên, nướng tăng lên Thực phẩm chiên, nướng thường lựa chọn cho buổi tụ họp bạn bè hay sum họp bên gia đình người Việt Nam Ngoài các món ăn chiên, nướng truyền thống như: Chả quạt; Thịt xiên nướng, v.v, gần đây, số lượng nhà hàng/ quán ăn đồ chiên, nướng theo kiểu BBQ cũng có xu hướng tăng lên nhiều Khảo sát “Nghiên cứu thói quen ăn đồ nướng Việt Nam” thực thống kê vào tháng 10/2018, dịch vụ nghiên cứu thị trường cơng ty Asia Plus Inc nhằm tìm hiểu thói quen ăn đồ nướng người Việt Nam Khảo sát thực 580 người dân, độ tuổi 22-40 sống Hà Nội thành phố Hồ Chí Minh Kết khảo sát cho thấy:  Có 96% số người tham gia khảo sát ăn BBQ nhà hàng/quán ăn với tần suất lần/năm Trong đó, 4% số người tham gia thường xuyên ăn (trên lần/tuần); 52% số người chọn 1-3 lần/tháng Lí 4% số người cịn lại chọn khơng thường xun ăn BBQ nhà hàng gồm: tần suất ăn lần/năm; không ăn BBQ; ăn BBQ gia đình.v.v Hình 1.2.1 Tần suất ăn BBQ tại nhà hàng đặt tên hình ko cần đến số chương Hình số Là đc Các nhà hàng BBQ được biết đến nhiều nhất ở Việt Nam kể đến: King BBQ (71%); Sumo BBQ (49%); Gogi House (44%); Hun Khoi BBQ Restaurant (15%); SKY Garden & CRAFT Beer (13%); v.v Trong đó, riêng hệ thống King BBQ có sự phát triển mạnh về số lượng nhà hàng vòng năm từ 2011 đến 17/07/2015 có tất cả 24 nhà hàng và từ 2015 đến có tới 85 nhà hàng tồn quốc Hình 1.2.2 Các nhà hàng BBQ phở biến ở Việt Nam Theo những số liệu trên, tần suất ăn BBQ trung bình là 1-3 lần/ tháng, số lượng nhà hàng BBQ tăng nhanh năm (2011-2019), cho thấy nhu cầu sử dụng thực phẩm chiên nướng có xu hướng tăng lên Tuy nhiên, quá trình chiên nướng, các thành phần hóa học của thịt biến đổi tạo thành các hợp chất khác, bao gồm cả các hợp chất không mong muốn amin dị vòng (Heterocyclic amines) Đang cần viết nối với khác dầu mỡ - Cùng với thay đổi theo phong cách ăn uống, Trào lưu ăn nướng - Cùng với thay đổi tư ăn uống, ăn đủ ăn ngon ăn an tồn, có thay đổi sử dụng - - Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiên nướng, nhiên với mục đích đề tài chúng tập trung vào chất tải nhiệt  có số nghiên cứu thấy sự ảnh hưởng của sốt nên có ngoại suy là dầu, mỡ cũng ảnh hưởng đến quá trình nướng C2: nói về HCAs rồi đến phần có số nghiên cứu thì thấy ảnh hưởng của chất tải nhiệt nên 1.3 Tổng quan Heterocyclic amines (HCAs) 1.3.1 Tổng quan chung HCAs Heterocyclic amines (HCAs) hợp chất amin dị vịng hình thành từ phản ứng creatine creatinine, axit amin đường khử thịt, cá chế biến nhiệt độ Chúng nguyên nhân gây ung thư người Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) coi số chất HCAs chất gây ung thư 2-amino-3,4-dimetyl-imidazo[4,5-f] quinoxaline (MeIQx), 2- amino3,4-dimetyl-imidazo [4,5-b] quinolin (MeIQ), 2-amino-1-metyl-6- phenylimidazo [4,5-b] pyridin (PhIP) Sự đột biến gen gây HCAs thịt đánh giá cách sử dụng thử nghiệm “Microsom test of Ames/Salmonella” [12] HCAs phân thành hai nhóm là: - Aminoimidazozoarenes (AIAs) - Aminocarbolines  IQ: R=H  MeIQ: R=CH3 grade 12 Toluene Methylene chloride (CH2Cl2) Exterelut NT packingmaterial MCX Oasis Cartridge 150mg Nước cất Mỡ lợn Dầu gạo Simply 13 14 15 16 17 18 Sigma-Aldrich #179418-1L Fisher #D37-4 Millipore Sigma #1150921000 Waters #MCX1860002 56 ACS grade Nước cất lần Cái Lân 2.3 Phương pháp phân tích 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu thực phẩm 2.3.1.1 Phương pháp tạo mẫu thực phẩm Nghiên cứu thực 25 mẫu thực phẩm gồm: - Mẫu mỡ lợn (1 mẫu) - Mẫu thịt bò, thịt lợn ba chỉ, ức gà rán với mỡ lợn dầu thực vật mức độ chín kỹ chín kỹ (12 mẫu) - Mẫu thịt bị, thịt lợn ba chỉ, đùi gà nướng khơng ướp có ướp dầu gạo trước nướng mức 2, 4, 6g dầu /100g thịt (12 mẫu) Số liệu trình tạo mẫu thịt rán, nướng cho bảng 2.3.1 2.3.2 Bảng 2.3.11: Các mẫu thực phẩm rán với mỡ lợn dầu thực vật Mẫu Lượng Thời Tên Mức độ Rán dầu/ mỡ gian mẫu chín dầu/mỡ (thìa nấu canh) (phút) Mỡ lợn Nhiệt độ (ºC) Nhiệt Nhiệt độ tâm độ đáy chảo 37 224 226 Nhiệt độ mặt bên Steak bị Chín kỹ Dầu 13 80 200 89 rán (tâm 80ºC) Mỡ 20 80 211 97 Chín kỹ Dầu 17 85 178 83 Mỡ 15 86 114 87 (tâm 85ºC) Thịt lợn Chín kỹ Dầu 10 80 199 88 ba (tâm 80ºC) Mỡ 11 80 190 71 rán Chín kỹ Dầu 18 90 222 79 (tâm 90ºC) Mỡ 19 90 198 76 Ức gà Chín kỹ Dầu 85 156 86 rán (tâm 85ºC) Mỡ 10 85 156 75 Chín kỹ Dầu 14 100 170 75 (tâm 100ºC) Mỡ 21 99 178 79 Bảng 2.3.12: Các mẫu thực phẩm nướng khơng ướp có ướp dầu gạo trước nướng Mẫu Thời Thời gian Nhiệt độ bề Nhiệt độ Lượng dầu gian ướp nướng mặt (ºC) lửa (ºC) ướp (g dầu (phút) (phút) - 12 202 286 30 12 199 286 30 12 197 286 30 12 205 286 Thịt lợn ba - 210 300 nướng 25 286 300 25 9.5 185 300 25 11.5 169 300 BBQ gà - 30 206 284 (nướng 15 phút 25 30 205 284 mặt) 25 30 206 284 25 30 206 284 Tên mẫu /100g thịt) BBQ bò Đọc mỡ, dầu (điểm khói, thành phần acid béo) Mỡ lợn tươi (mỡ thái miếng nhỏ) chần, sau rán cho mỡ đến miếng tóp có màu vàng nhạt Mỡ lợn sau bỏ tóp đựng lọ thủy tinh, bảo quản tủ đông -4ºC Đối với thực phẩm rán: Các miếng thịt rán hai mặt chảo chống dính với mỡ lợn dầu thực vật, nhiệt độ tâm, nhiệt độ bề mặt nhiệt độ mặt bên miếng thịt đo nhiệt kế suốt trình rán Thịt bị thăn (dày 2-2.5cm, nặng trung bình 106g), thìa mỡ lợn/dầu thực vật, trình rán kết thúc nhiệt độ tâm đạt 80ºC (chín kỹ) 85ºC (chín kỹ) Thịt lợn ba (dày 3cm, chứa bì, nặng trung bình 108g), thìa mỡ/dầu thực vật nhiệt độ tâm 80ºC (chín kỹ) 90ºC (chín kỹ) Thịt ức gà (nặng trung bình 43g), thìa mỡ/dầu thực vật nhiệt độ tâm 85ºC (chín kỹ) 100ºC (chín kỹ) Đối với thực phẩm nướng: Nguyên liệu gồm thịt bò dày 1cm, thịt lợn ba dày khoảng 3mm thịt đùi gà 3.5 cm, mẫu nặng trung bình 100g Các mẫu thực phẩm chuẩn bị gồm: mẫu đối chứng (thịt nướng không ướp dầu) mẫu thịt ướp với dầu gạo mức 2, 4, 6g dầu/ 100g thịt trước nướng Thịt nướng mặt trực tiếp than hoa Trong trình nướng, nhiệt độ bề mặt thịt đo nhiệt kế, nhiệt độ lửa trì 300ºC Mẫu thịt sau chế biến bảo quản túi zip nhiệt độ -4ºC 2.3.1.2 Phương pháp xử lý mẫu thực phẩm Xử lý mẫu thịt dựa theo phương pháp Weijuan Ni cộng theo quy trình sau: Nghiền nhỏ g thịt, đồng với NaOH 0,1N (4ml/1g thịt), bổ sung 20ng chất nội chuẩn Nhồi chất Extrelut resin có chứa mẫu thịt vào cột Bond Elut reservoir Trộn 6g Extrelut resin cốc thủy tinh Làm khô tủ sấy, 30 phút Rửa chất resin 40ml hexane Dùng Supelco adaptor nối Bond Elut reservoir với ống Waters Oasis MCX LP extraction (150mg) Ống MCX rửa NH4OH 5% MeOH (2ml), sau rửa axit acetic 2% MeOH (2ml) Rửa HCAs từ Extrelut resin Toluene 5% CH2Cl2 (2*20ml) Bỏ cột Bond Elut reservoir Nhỏ Toluene 5% CH2Cl2 (2*20ml); HCl 0,04N: MeOH (2ml); 2ml MeOH; 2ml H2O NH4:MeOH: H2O (2:15:85, 2ml) vào ống MCX catridige Tách rửa HCAs từ resin ml NH4OH 5%: MeOH ống Eppendorf 30s Chất rửa giải chứa HCAs để tủ hút 30 phút để loại amoniac Làm giàu đến khô máy ly tâm chân không, nhiệt độ thường Hình phẩm Phần chất rắn hòa tan2.3.8: Quy trình xử lý mẫu Phân thực tích HPCL-MSn dung mơi MeOH:H2O (1:1) 2.3.2 Phương pháp phân tích PhIP, MeIQx phương pháp LC-MSn 2.3.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích PhIP, MeIQx a) Áp dụng điều kiện chạy máy của Ths Đặng Thùy Linh - Hệ sắc ký lỏng ghép khối phổ: UHPLC-UltiMate, LCQ-Fleet Ion Trap (Thermo) - Ct c s dng: Purospherđ STAR RP-18 endcapped (2àm) Hibarđ HR 100-2.1 (Cột sắc ký RP18, chiều dài 100 mm, kích thước hạt nhồi 2µm) - Thể tích bơm mẫu 20µl - Tiến hành cố định thơng số buồng MS sau: +) Chế độ full scan: 50-400 m/z +) Capillary Temp: 200oC +) Capillary Voltage: 25V - Kênh A: 0.05% axit formic, 10% ACN nước cất - Kênh B: 0.05% axit formic, 10% nước cất ACN - Nhiệt độ cột: 25oC - Tốc độ dòng: 0.2ml/phút - Chương trình gradient: - Thời gian (phút) 10 12 13 15 %B 10 10 100 100 10 Điều kiện chạy phối khổ Thông số MS Heater Temp (oC) 250 Sheath Gas Flow Rate (arb) 45 Aux Gas Flow Rate (arb) 28 Sweep Gas Flow Rate (arb) Capilary Temp (oC) 300 Spray voltage (V) 25 Tube Lens 80 SRM P (m/z) D (m/z) CE PhIP 225.1 210.1 30 d3-PhIP 228.1 MeIQx 214.1 d3-MeIQx 217.1 140.1 210.1 140.1 199.1 131.1 199.1 131.1 25 30 25 30 25 30 25 b) Chỉnh sửa chế độ gradient Tiến hành tách, rửa giải lúc chất nhóm HCAs, và chất có cấu trúc gần giớng chất ban đầu, đồng thời kết hợp với tài liệu tham khảo phương pháp phân tích trước đây, ta tiến hành khảo sát chế độ gradient khác Cài đặt phần mềm Xcaliber, hút 20µl dung dịch hỗn hợp chất chuẩn PhIP (250ppb) MeIQx (250ppb), cho máy chạy với điều kiện bảng 2.3.3, so sánh tín hiệu lựa chọn điều kiện thích hợp Bảng 2.3.13: Chế độ gradient 2.3.2.2 Thẩm định phương pháp Các thông số thẩm định đồ án bao gồm: - Tính đặc hiệu, tính chọn lọc - Khoảng tuyến tính và đường chuẩn - Giới hạn phát hiện - Giới hạn định lượng - Độ chụm - Độ đúng - Độ vững, ổn định của phương pháp a) Tính đặc hiệu, tính chọn lọc b) Khoảng tuyến tính và đường chuẩn - Phương pháp: xây dựng đường chuẩn có sử dụng nội chuẩn - Xây dựng đường chuẩn với các mức nồng độ bảng: Bảng 2.3-1 Nồng độ dung dịch chạy đường chuẩn Nồng độ ban Nồng độ (ppb) đầu (ppb) PhIP 5.75 287,5 143.75 71.875 35.94 17.97 8.985 MeIQx 8.42 526.25 263.125 131.56 65.78 32.89 16.445 d3-PhIP 2.473 62 62 62 62 62 62 d3-MeIQx 0.528 132 132 132 132 132 132 - Mỗi nồng độ tiến hành chạy lần để kiểm tra độ lặp của các nồng độ chuẩn - Nồng độ nội chuẩn bổ sung vào mẫu là 20 ppb c) Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Đồ án đã xác định LOD, LOQ dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo (dựa đường chuẩn) Chuẩn bị mẫu có bổ sung chất chuẩn nội chuẩn PhIP, d3-PhIP, MeIQx, d3MeIQx có nồng độ lần lượng sau: 5, 20, 5, 20 (ppb) Phân tích 10 lần lặp lại tính LOD LOQ theo công thức sau: LOD = Trong đó: 3.3× SD a LOQ = 10× SD a SD: Đợ lệch chuẩn của tín hiệu a: Độ dốc của đường chuẩn Ngoài ra, giá trị RSD% cần phải đạt mức yêu cầu cho từng nồng độ cụ thể d) Độ chụm Độ chụm được tính toán các kết quả phân tích mẫu thực đã làm Bố trí làm 10 mẫu (thịt lợn, thịt gà, thịt bò) với hình thức nướng và rán được làm lặp lại lần Mẫu Mẫu Bò nướng 0g dầu Bò rán 80 mỡ Bò nướng 2g dầu Bò rán 80 dầu Lợn nướng 0g dầu Lợn rán 90 mỡ Lợn nướng 2g dầu Lợn rán 90 dầu Gà nướng 0g dầu Gà nướng g dầu - Độ lệch giữa hai kết quả lặp lại của mỗi mẫu: di =|x 1−x 2| - Độ lệch trung bình: dtb = ∑ di n - Giá trị trung bình giữa hai kết quả lặp mỗi mẫu: xi = - Giá trị trung bình: X = - Độ lệch chuẩn s = - Độ lêch chuẩn tương đối: RSD% = x1 + x 2 ∑ xi n dtb 1.118 s × 100 X e) Đợ đúng Đồ án xác định độ đúng thông qua xác định đợ thu hời Tiến hành xử lý mẫu trắng có bổ sung chất chuẩn với nồng độ nồng độ 10,20 50ppb theo quy trình xác định độ thu hồi phương pháp xử lý mẫu (lặp lại lần) Xác định hiệu suất thu hồi phương pháp lựa chọn theo công thức sau: R% = Ctt × 100 Clt R%: Hiệu suất thu hồi (%) Ctt: Nồng độ HCAs tính theo đường chuẩn Clt: Nồng độ thực tế HCAs tiêm vào mẫu chuẩn 2.3.3 Phương pháp phân tích PhIP, MeIQx thực phẩm qua chế biến nhiệt độ cao phương pháp LC-MSn Tiến hành phân tích 25 mẫu thực phẩm xử lý mục 2.3.1 theo phương pháp mục 2.3.2 CHƯƠNG 3.1 Kết xử lý mẫu thực phẩm 3.1.1 Kết tạo mẫu thực phẩm KẾT QUẢ Bảng 3.1.14: Kết tạo mẫu thực phẩm rán với mỡ lợn dầu thực vật Tên mẫu Mức độ chín Hình ảnh mẫu thực phẩm Mẫu rán với dầu Mỡ lợn Steak bị rán Chín kỹ (tâm 80ºC) Chín kỹ (tâm 90ºC) Thịt lợn ba Chín kỹ (tâm 80ºC) rán Chín kỹ (tâm 90ºC) Ức gà rán Chín kỹ (tâm 85ºC) Mẫu rán với mỡ lợn Chín kỹ (tâm 100ºC) Bảng 3.1.15: Kết tạo mẫu thực phẩm nướng khơng ướp có ướp dầu gạo Mẫu 0g dầu/ 100g thịt 2g dầu/100g thịt 4g dầu/100g thịt 6g dầu/100g thịt BBQ bò Thịt lợn ba nướn g BBQ gà Nhận xét: Mẫu thịt lợn nướng: ướp nhiều dầu gạo thời gian nướng lâu miếng thịt không bị cháy (do có mỡ từ miếng thịt chảy xuống nên lửa cháy nhỏ hơn, thịt bị đen hơn) Nhiệt độ lửa khoảng 300ºC mẫu thịt nướng khơng ướp hay có ướp dầu gạo - Dầu ướp thịt giúp giảm tiếp xúc trực tiếp protein thịt với nhiệt độ cao nên giảm hình thành HCAs - 3.1.2 Kết xử lý mẫu thực phẩm 3.2 Kết phân tích PhIP, MeIQx thực phẩm qua chế biến nhiệt độ cao phương pháp LC-MSn 3.2.1 Kết xây dựng phương pháp phân tích PhIP, MeIQx a) Kết xác định hiệu suất thu hồi phương pháp xử lý mẫu Trong trình xử lý mẫu, mẫu xử lý qua nhiều giai đoạn, từ làm đến rửa giải thu HCAs không tránh khỏi việc rửa trơi PhIP MeIQx mẫu sau q trình xử lý Ngồi ra, mẫu xử lý có bổ sung nội chuẩn tiêu chí đánh giá hiệu trình thu HCAs Kết xác định hiệu suất thu hồi thể bảng sau: Bảng 3.2.16: Kết xác định độ thu hồi phương pháp mức nồng độ 10 ppb Chất Thông số PhIP C (ppb) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TB SD RSD% H% d3-PhIP C (ppb) H% MeIQx C (ppb) H% d3-MeIQx C (ppb) H% b) Kêt thẩm định phương pháp  Kết xây dựng đường chuẩn Do mẫu thực đối tượng gồm nhiều loại thịt cách chế biến khác nên xây dựng đường chuẩn mẫu trắng gặp nhiều khó khăn, tiến hành lập đường chuẩn dung môi MeOH: nước cất (1:1) Ta tiến hành lập đường chuẩn Kết theo bảng sau: Bảng 3.2.17: Kết lập đường chuẩn HCAs có sử dụng nội chuẩn PhIP d3-PhIP MeIQx d3-MeIQx Nồng độ Diện Nồng độ Diện Nồng độ Diện Nồng độ Diện (ng/ml) tích (ng/ml) tích (ng/ml) tích (ng/ml) tích peak 8,985 4115 peak 62 22720 peak 16.445 2784 peak 132 18265 17,970 7536 62 21967 32.890 5096 132 17385 35,940 13847 62 21446 65.780 10073 132 16907 71,875 25628 62 20421 131.560 17856 132 16070 143,750 48438 62 19625 263.125 34747 132 15846 287,500 87000 62 16886 526.250 63528 132 14174 Tiến hành lập mối quan hệ tỷ lệ diện tích peak chất chuẩn/ diện tích peak SPhIP/Sd3-PhIP chất nội chuẩn với nồng độ HCAs, ta dựng đường chuẩn PhIP, MeIQx Đường chuẩn PhIP sử dụng nội chuẩn f(x) = 0.0177800814880706 x − 0.00349814933545356 R² = 0.999389149021609 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ PhIP (ng/ml) SMeIQx/Sd3-MeIQx Hình 3.2.9: Đường chuẩn PhIP sử dụng nội chuẩn Đường chuẩn MeIQx sử dụng nội chuẩn 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 f(x) = 0.00845495994807111 x + 0.0114149886598178 R² = 0.999763441019695 100 200 300 400 500 600 Nồng độ MeIQx (ng/ml) Hình 3.2.10: Đường chuẩn MeIQx sử dụng nội chuẩn Nhận xét: Tỷ lệ diện tích peak chất chuẩn/ diện tích peak nội chuẩn tuyến tính với nồng độ PhIP MeIQx với hệ số tương quan R2> 0.99 3.2.2 STT Kết phân tích PhIP, MeIQx mẫu thực phẩm Tên mẫu Điều kiện nấu Nồng độ Nồng độ Rán với Mức độ Ướp dầu PhIP MeIQx mỡ lợn chín gạo trước (ng/5g) (ng/5g) dầu (nhiệt độ nướng (g thực vật tâm-ºC) dầu/ 100g 0g 179.929 22.279 2g 182.351 1.3981 10.4 nd 77.21 20.4 thịt) Thịt bò nướng 130oC-15 Thịt bò rán BBQ bò phút Mẫu mua KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO [13] Felton, J.S., Knize, M.G., Shen, N.H., Lewis, P.R., Andresen, B.D., Happe, J & Hatch, F.T (1986a) “The isolation and identification of a new mutagen from fried groundbeef:2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo(4,5-b) pyridine (PhlP)” Carcinogenesis, 7, 1081-1086 [2] [15] Gross, G.A (1999) Simple methods for quantifying mutagenic heterocyclic aromaticaminesinfoodproducts.Carcinogenesis,ll,1597-1603 [3] [02] http://www.californiariceoil.com/nutrition.htm [4] [12] Internatıonal Agency for Research on Cancer (1993) IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans In Some Natural Occurring Substances: Food Items and Constituents.Heterocyclic Amines and Mycotoxins, International Agency for Research on Cancer, Lyon 56: 163–242 [5] [04] Jennifer Good Healthiest Cooking Oil Comparison Chart with Smoke Points and Omega Fatty Acid Ratios (1999-2019) The Baseline of Health Foundation https://jonbarron.org/diet-and-nutrition/healthiest-cooking-oil-chart- smoke-points) [6] [06] Jiyeong Lee, Ahyoung Dong, Kyunghee Jung, and Han-Seung Shin (2011) Influence of Extra Virgin Olive Oil on the Formation of Heterocyclic Amines in Roasted Beef Steak Food Sci Biotechnol 20(1): 159-165 [7] [11] Lu, F., Kuhnle, G K and Cheng, Q (2017) Vegetable oil as fat replacer inhibits formation of heterocyclic amines and polycyclic aromatic hydrocarbons in reduced fat pork patties Food Control, 81 pp 113125 [8] [14] Mevlüde Kizil1*, Fatih Oz2 and H Tanju Besler1 (2011) A Review on the Formation of Carcinogenic/Mutagenic Heterocyclic Aromatic Amines Food Processing & Technology, 2157-711 [9] [08] Motoki Iwasaki cộng (2010) Heterocyclic amines content of meat and fish cooked by Brazilian methods J Food Compost Anal, 23(1): 61–69 [10] [10] 10 Ni W1, McNaughton L, LeMaster DM, Sinha R, Turesky RJ (2008) Quantitation of 13 heterocyclic aromatic amines in cooked beef, pork, and chicken by liquid chromatography-electrospray ionization/tandem mass spectrometry J Agric Food Chem, 56, 68–78 [11] [1] 11 Samantha A Vieira, David Julian McClements, Eric A Decker (2015) Challenges of Utilizing Healthy Fats in Foods Adv Nutr 6(3): 309S–317S [12] [16] 12 Ths Đặng Thùy Linh [1] [05] 13 Ths.Bs Ngô Thị Hà Phương Viện Dinh dưỡng Quốc gia Chất béo giá trị dinh dưỡng chất béo số thực phẩm http://viendinhduong.vn/vi/tin-tuc -su-kien-noi-bat/chat-beo-va-gia-tri-dinh-duongcua-chat-beo-trong-mot-so-thuc-pham.html ) [13] [09] 14 Trần Cao Sơn Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010) Thẩm định phương pháp phân tích hố học vi sinh vật [14] [00] 15 World Health Organization, (2018), “Cancer” [online], truy cập 17 tháng năm 2018, from: [15] [03] 16 Z balogh, J.I Gray, E.A Gomaa, A.M Booren (2000) Formation and inhibition of heterocyclic aromatic amines in fried ground beef patties Food and Chemical Toxicology.Vol 38, Issue 5, P 395-401) [16] ... lý mẫu thực phẩm 40 Hình 3.2.1: Đường chuẩn PhIP sử dụng nội chuẩn 46 Hình 3.2.2: Đường chuẩn MeIQx sử dụng nội chuẩn 47 Đề tài: Phân tích PhIP, MeIQx thực phẩm qua chế biến Mở... phẩm từ đủ thực phẩm để dùng  thực phẩm ngon  thực phẩm sạch, ngon, tiện Hai phương pháp để làm chín thực phẩm phương pháp chế biến thực phẩm không sử dụng nhiệt phương pháp chế biến sử dụng... HCAs Phương pháp chế biến ảnh hưởng đến hình thành HCAs thực phẩm chế biến 1.4 PhIP, MeIQx thực phẩm qua chế biến Theo nghiên cứu Motoki Iwasaki cộng (2010) [8], hàm lượng PhIP MeIQx số loại thịt