Luận văn thạc sỹ khoa học lưu thị lan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LƯU THỊ LAN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CORDYCEPS MILITARIS CM5 NHẰM THU SINH KHỐI VÀ CORDYCEPIN CAO NHẤT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LƯU THỊ LAN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CORDYCEPS MILITARIS CM5 NHẰM THU SINH KHỐI VÀ CORDYCEPIN CAO NHẤT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS KHUẤT HỮU THANH Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập nghiên cứu ngồi cố gắng, nỗ lực thân Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Khuất Hữu Thanh, Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Thầy ln tận tình hướng dẫn bảo, gợi mở tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trung tâm nghiên cứu phát triển CNSH - trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực luận văn tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo giảng dạy năm qua, kiến thức mà nhận giảng đường đại học, cao học hành trang giúp vững bước tương lai Tôi muốn gửi lời cảm ơn đến anh chị bạn nhóm nghiên cứu giúp đỡ cho lời khun bổ ích chun mơn q trình nghiên cứu Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè… người ln kịp thời động viên, chia sẻ, giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Lưu Thị Lan LỜI CAM ĐOAN Tôi Lưu Thị Lan xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tơi, hướng dẫn PGS TS Khuất Hữu Thanh "Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy Cordyceps militaris CM5 nhằm thu sinh khối cordycepin cao nhất" Các kết quả, số liệu nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày tháng Lưu Thị Lan năm 2015 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan BẢNG CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ĐTHT Đông trùng hạ thảo PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Cs Cộng C militaris Cordyceps militaris (Nhộng trùng thảo) EPS Exopolysaccharide (Extracellular polysaccharide) Polysaccharide ngoại bào IPS Intracellular polysaccharide Polysaccharide nội bào EtOH Ethanol HPLC High Performace Liquid Chromatography – Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sp Species – Một loài spp Species plural- Nhiều loài rpm Tốc độ lắc vịng/ phút vvm Thể tích khơng khí thể tích mơi trường/ phút I Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BẢNG II Bảng 1.1 Mơ tả hình thái số loài nấm thuộc chi Cordyceps [19] .6 Bảng 1.2 Mô tả mặt cắt phần thể ấu trùng mặt cắt phần chất chủng Cordyceps Bảng 1.3 Thống kê kết nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo Cordyceps giới 23 Bảng 2.1 Ma trận thực nghiệm, yếu tố 38 Bảng 3.1 Giá trị mã hóa thực nghiệm yếu tố thực nghiệm 50 Bảng 3.2 Kết thí nghiệm 51 Bảng 3.3 Phân tích phương sai ANOVA mơ hình .53 Bảng 3.4 Hàm lượng cordycepin adenosine tích lũy sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 65 Bảng 3.5 Hàm lượng cordycepin adenosine tích lũy sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 67 II Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nhộng Đơng trùng hạ thảo C militaris .3 Hình 1.2 Hình ảnh nấm ĐTHT phát triển trùng Hình 1.3 Chu trình sinh trưởng trùng (Hepialus armoricanus) Cordyceps [38] Hình 1.4 Hình ảnh C militaris C sinensis tự nhiên .5 Hình 1.5 Hình ảnh nấm ĐTHT phát triển côn trùng Hình 1.6 Chu trình sinh trưởng trùng (Hepialus armoricanus) Cordyceps [38] Hình 1.7: Hình thái tự nhiên số chủng nấm Cordyceps: A- C.sinensis; B-C.gunnii; C-C Barnesii; D-C.gracilis; E-C.liangshanensis; F-C.militaris [19] Hình 1.8 Bề mặt cắt ngang thể ấu trùng chủng Cordyceps: (A) C.sinensis; (B) C.gunnii; (C) C Barnesii; (D) C.gracilis; (E) C.liangshanensis; (F) C.militaris [36] Hình 1.9 Mặt cắt hiển vi phần chất chủng Cordyceps, (A) C.sinensis; (B) C.gunnii; (C) C Barnesii; (D) -C.liangshanensis; (E) C.militaris [36] Hình 1.10 Hình ảnh khối nấm mũ C militaris [39] 10 Hình 1.11 Hình ảnh thể nang C militaris [39] .10 Hình 1.11 Hình ảnh bào tử túi C militaris [39] 11 Hình 1.12 Vịng đời C militaris [36] 11 Hình 1.13 Chu trình xâm nhiễm nấm ký sinh trùng [9] .13 Hình 1.14 Cơng thức hóa học Adenosine, Deoxyadenosine Cordycepin .14 Hình 1.15 Cấu trúc hóa học Adenosine Cordycepin 14 Hình 1.16 Hình ảnh ni trồng thể công ty ĐTHT Kim Lai 26 III Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan Hình 2.1 Chủng C militaris CM5 bảo quản thạch nghiêng đĩa petri 32 Hình 2.2 Hệ thống sắc kí lỏng cao áp -HPLC 34 Hình 2.3 Thiết bị lên men 2L (Satorius) 41 Hình 2.4 Sơ đồ hệ thống HPLC .42 Hình 3.1 Sự ảnh hưởng điều kiện cấp giống đến phát triển sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 45 Hình 3.2 Sự ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến phát triển sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 46 Hình 3.3 Hình ảnh ni cấy chủng C militaris CM5 môi trường MT1, MT2, MT3, MTCB 47 Hình 3.4 Sự ảnh hưởng pH mơi trường nuôi cấy đến phát triển sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 48 Hình 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển sinh khối chủng C militaris CM5 .49 Hình 3.6: Hình ảnh ni cấy chủng C militaris CM5 .49 Hình 3.7 Ảnh hưởng yếu tố đến khả tạo sinh khối .55 (đường A: pH; đường B: nhiệt độ; đường C: thời gian) 55 Hình 3.8 Bề mặt đáp ứng hàm lượng sinh khối: (a) Khi pH nhiệt độ thay đổi, (b) Khi pH thời gian thay đổi, (c) nhiệt độ thời gian thay đổi 56 Hình 3.9 Mức độ đáp ứng mong đợi 57 Hình 3.10 Biểu đồ thể hàm lượng sinh khối khơ bình tam giác 250ml thực nghiệm lý thuyết chủng C militaris CM5 .61 Hình 3.11 Biểu đồ thể hàm lượng sinh khối khô thiết bị lên men 2L thực nghiệm lý thuyết chủng C militaris CM5 62 IV Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan Hình 3.12 Biểu đồ thể hàm lượng sinh khối khơ bình thủy tinh 8L thực nghiệm lý thuyết chủng C militaris CM5 63 Hình 3.13 Hình ảnh ni cấy chủng C militaris CM5 bình 8L .64 Hình 3.14 A - Sắc ký đồ cordycepin adenosine chuẩn (Sigma) 65 B - Sắc ký đồ cordycepin adenosine hệ sợi nấm C militaris CM5 65 Hình 3.15 Sắc kí đồ adenosine cordycepin từ sinh khối nuôi cấy chủng nấm C militaris CM5 67 V Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan MỤC LỤC BẢNG CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT I DANH MỤC BẢNG II DANH MỤC HÌNH III MỤC LỤC VI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .3 1.1 Sơ lược nấm Đông trùng hạ thảo .3 1.2 Nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps sp.) 1.2.1 Phân loại khoa học [31] .4 1.2.2 Nguồn gốc phân bố [33] .5 1.3 Cấu tạo chế lây nhiễm nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào thể côn trùng .6 1.3.1 Cấu tạo hình thái loài nấm thuộc chi Cordyceps 1.3.2 Cấu tạo nấm kính hiển vi Cordyceps 1.3.3 Hình thái học C militaris [39] 10 1.3.4 Vòng đời C militaris 11 1.3.5 Quá trình xâm nhiễm nấm C militaris vào thể trùng 11 1.4 Các thành phần hóa học Cordyceps .13 1.4.1 Cordycepin ( 3- deoxyadenosine ) 14 1.4.2 Adenosin 15 1.4.3 SOD 15 1.4.4 Polysaccharide 15 1.4.5 Manitol 16 1.4.6 Acid Cordycepic (một dạng D-mannitol) 16 1.4.7 Nucleotide 16 1.4.8 Sterol 16 VI Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan Hình 3.10 Biểu đồ thể hàm lượng sinh khối khô bình tam giác 250ml thực nghiệm lý thuyết chủng C militaris CM5 Khi ni cấy bình tam giác 250ml sinh khối phát triển bình thường, sinh khối đóng thành mảng, bắm chặt vào viền bình Qua q trình ni cấy thể tích 250ml, chủng C militaris CM5 trì khả phát triển sinh khối hệ sợi cao So sánh với kết nghiên cứu lên men chìm chủng nấm C militaris C738 Kim cs (2003) sinh khối hệ sợi thu 20,26g/l [23] Và nghiên cứu lên men chìm kết hợp tĩnh lắc Shih cs (2006) sinh khối hệ sợi thu 22,3g/l [21] Từ kết cho thấy sinh khối hệ sợi thu nghiên cứu cao so với nghiên cứu trước 3.4 Nuôi cấy thử nghiệm quy mô lớn 3.4.1 Nuôi cấy chủng C militaris CM5 thiết bị lên men L Chúng tiến hành nuôi chủng C militaris CM5 thiết bị lên men 2L (Satorius), chứa môi trường MT1; nhiệt độ 20,0°C; pH 6,5; tỷ lệ cấp giống 5% canh trường dịch nuôi Sau 17 ngày nuôi tiến hành ly tâm thu sinh khối, sấy khô 50oC đến khối lượng không đổi thu kết sau: 61 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan Kết sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 bình 2L sinh khối khơ là: 28,98±1,98g/l 89% sinh khối theo tối ưu lý thuyết So với nuôi cấy xác định đơn yếu tố = 20,19g/l tăng 44% Hình 3.11 Biểu đồ thể hàm lượng sinh khối khô thiết bị lên men 2L thực nghiệm lý thuyết chủng C militaris CM5 Khi ni cấy bình 2L, tơi sử dụng hệ thống khuấy sục khí, giai đoạn đầu, sinh khối chưa dày đặc, chế độ khuấy trì tốc độ thấy, cấp O2 mức thấp Khi nuôi đến ngày thứ sinh khối phát triển đặc kín thể tích lên men, tốc độ khuấy điều chỉnh tăng cao khơng khí cấp vào bình mức lớn Đến ngày thứ 10, sinh khối đóng thành mảng dày, bắm chặt vào viền bình Qua q trình ni cấy thể tích lớn, chủng C militaris CM5 trì khả phát triển sinh khối hệ sợi cao 3.4.2 Nuôi cấy chủng C militaris CM5 bình thủy tinh 8L Tơi tiến hành ni chủng C militaris CM5 bình tam giác 8L chứa 2L môi trường MT1, tỷ lệ cấp giống 5% canh trường dịch nuôi, pH-6,5 Sau 17 ngày nuôi tiến hành thu sinh khối, sấy khô thu kết sau: 62 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan Kết sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 bình 8L sinh khối khơ 26,12±1,87g/l 80% sinh khối theo tối ưu lý thuyết So với nuôi cấy xác định đơn yếu tố = 20,19g/l tăng 29% Hình 3.12 Biểu đồ thể hàm lượng sinh khối khơ bình thủy tinh 8L thực nghiệm lý thuyết chủng C militaris CM5 Khi ni cấy bình 8L, tơi sử dụng hệ thống khuấy sục khí, nhiệt độ thường khoảng 25°C, giai đoạn đầu, sinh khối chưa dày đặc, chế độ khuấy trì tốc độ thấy, cấp O2 mức thấp Khi nuôi đến ngày thứ 7, sinh khối tan thành sợi mảnh, phát triển đặc kín thể tích lên men, tốc độ khuấy điều chỉnh tăng cao khơng khí cấp vào bình mức lớn Đến ngày thứ 14, sinh khối đóng thành mảng dày, bắm chặt vào viền bình Qua trình ni cấy thể tích lớn, chủng C militaris CM5 trì khả phát triển sinh khối hệ sợi cao 63 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan Hình 3.13 Hình ảnh ni cấy chủng C militaris CM5 bình 8L 3.5 Kết phân tích hàm lượng cordycepin adenosine sinh khối khô chủng C militaris CM5 3.5.1 Kiểm tra khả tích lũy cordycepin, adenosine chủng C militaris CM5 phương pháp HPLC Trong trình nghiên cứu khả phát triển sinh khối tích lũy hoạt chất quý chủng C militaris CM5 cho khả tích lũy cordycepin adenosine cao Vì chúng tơi bước đầu khảo sát khả tích lũy hoạt chất sinh học quý chủng CM5 nuôi cấy môi trường MTCB theo thời gian hệ thống HPLC Để so sánh, sử dụng mẫu cordycepin adenosine chuẩn (Sigma) làm mẫu đối chứng Sau trình khảo sát, thu kết sau: 64 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan Hình 3.14 A - Sắc ký đồ cordycepin adenosine chuẩn (Sigma) B - Sắc ký đồ cordycepin adenosine hệ sợi nấm C militaris CM5 Hình 3.15 sắc ký đồ thu dịch chiết sinh khối nuôi cấy chủng C militaris CM5 cordycepin, adenosine chuẩn Đỉnh thời gian lưu 31,4 phút trùng adenosine chuẩn adenosine tách từ sinh khối nuôi cấy Đỉnh thời gian lưu 32,5 phút trùng cordycepin chuẩn cordycepin tách từ sinh khối nuôi cấy Hàm lượng cordycepin adenosine tích lũy sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 sau: Bảng 3.4 Hàm lượng cordycepin adenosine tích lũy sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 65 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan Adenosine Cordycepin (mg/g) (mg/g) ngày 3,85± 0,25 0,35 ±0,03 14 ngày 1,41 ± 0,04 0,59 ±0,11 21 ngày 0,91 ± 0,14 0,91 ± 0,23 28 ngày 0,42 ± 0,11 0,41 ± 0,11 Thời gian Từ kết nhận thấy sau ngày nuôi cấy, hàm lượng adenosine hệ sợi chủng C militaris CM5 tích lũy cao đạt 3,85 ± 0,25mg/g Hàm lượng cordycepin sinh khối hệ sợi khô đạt cao sau 21 ngày nuôi cấy 0,91 ± 0,23mg/g; Thời gian thu nhận cordycepin hệ sợi C militaris CM5 ni cấy chìm với mơi trường MTCB tốt vào khoảng ngày thứ 21 q trình ni cấy 3.5.2 Kiểm tra khả tích luỹ cordycepin, adenosine kiểm định mơ hình tối ưu chủng C militaris phương pháp HPLC Từ kết sinh khối khô thu kiểm định mơ hình tối ưu khả tạo sinh khối chủng C militaris CM5 thực nghiệm bình tam giác 250ml với điều kiện ni cấy: môi trường MT1; nhiệt độ 20,0°C; pH 6,5; tốc độ khuấy 120 vòng/ phút; tỷ lệ cấp giống 5% canh trường dịch nuôi Kết kiểm tra khả tích luỹ cordycepin, adenosine sinh khối chủng C militaris CM5 phương pháp HPLC sau: 66 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan Hình 3.15 Sắc kí đồ adenosine cordycepin từ sinh khối ni cấy chủng nấm C militaris CM5 Từ hình 3.15 hình 3.14 (A-sắc ký đồ thu cordycepin, adenosine chuẩn): đỉnh thời gian lưu 31,4 phút trùng adenosine chuẩn adenosine tách từ sinh khối nuôi cấy Đỉnh thời gian lưu 32,5 phút trùng cordycepin chuẩn cordycepin tách từ sinh khối nuôi cấy Hàm lượng cordycepin adenosine tích lũy sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 sau: Bảng 3.5 Hàm lượng cordycepin adenosine tích lũy sinh khối hệ sợi chủng C militaris CM5 Thời gian Adenosine (mg/g) Cordycepin (mg/g) 17 ngày 0,57± 0,30 2,67±0,40 Từ kết nhận thấy sau 17 ngày nuôi cấy; môi trường MT1; nhiệt độ 20,0°C; pH 6,5 thu hàm lượng adenosine hệ sợi chủng C militaris CM5 tích lũy cao đạt 0,57 ± 0,30mg/g Hàm lượng cordycepin sinh khối hệ sợi khô đạt cao 2,67 ± 0,40mg/g 67 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan Hàm lượng cordycepin hệ sợi chủng C militaris CM5 nghiên cứu tương tự kết thu nghiên cứu Ing- Lung Shih cộng 2006 [21] Và nghiên cứu tương tự kết thu nghiên cứu Lei Huang cộng 2009 [25] 68 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan KẾT LUẬN Đề tài nghiên cứu điều kiện nuôi cấy C militaris CM5 nhằm thu sinh khối cordycepin cao thu nhận số kết sau: Xác định yếu tố thích hợp nuôi cấy chủng C militaris CM5 khảo sát đơn yếu tố: môi trường MT1; pH 6,0; nhiệt độ 20,0°C thời gian nuôi cấy 14 ngày Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng C militaris CM5, xác định mơ hình tối ưu: pH = 6,5; nhiệt độ 20.0°C; thời gian 17 ngày sinh khối thu cao Kiểm định mơ hình tối ưu thực nghiệm cho thấy: Ở bình tam giác 250ml thực nghiệm thu 29,69g/l đạt 91% so với mơ hình tối ưu Khả tích luỹ cordycepin, adenosine: Sau ngày nuôi cấy, hàm lượng adenosine hệ sợi chủng C militaris CM5 tích lũy cao đạt 3,85 ± 0,25mg/g Hàm lượng cordycepin sinh khối hệ sợi khô đạt cao sau 21 ngày nuôi cấy 0,91 ± 0,23mg/g Thời gian thu nhận cordycepin hệ sợi C militaris CM5 ni cấy chìm tốt vào ngày thứ 21 q trình ni cấy Kiểm định mơ hình tối ưu chủng C militaris CM5 phương pháp HPLC: Sau 17 ngày nuôi cấy, hàm lượng adenosine hệ sợi chủng C militaris CM5 tích lũy cao đạt 0,57 ± 0,30mg/g Hàm lượng cordycepin sinh khối hệ sợi khô đạt cao 2,67 ± 0,40mg/g 69 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu nuôi cấy chủng C militaris CM5 thiết bị lên men lớn 30l, 100l nhằm xác định điều kiện sản xuất thực tiễn để tạo sản phẩm chức có giá trị cao phục vụ người 70 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng việt: [1] Báo điện tử Greenbiotech – Thực phẩm dinh dưỡng – Giải pháp sức khỏe cho người Ngày 25/07/2009 [2] Báo điện tử Thần dược Đông trùng hạ thảo – Câu lạc nấm trồng Việt Nam – Mush clubVN.com Ngày 3/5/2009 [3] Báo điện tử Thầy thuốc Của Bạn Vị thuốc đông y Đông trùng hạ thảo, ngày 25, tháng 1, năm 2010 [4] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Liên Hoa, Lê Hồng Yến, Nguyễn Văn Bắc.(2006) Chương trình vi sinh vật học - Nấm sợi [5] Nguyễn Mạnh Hà Phạm Quang Thu, (2009), Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:FR.) LINK vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn [6] Phạm Nữ Kim Hồng, Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Trương Kiến Khương, Lê Huyền Ái Thuý, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Ngun, (2010), Phát lồi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps pseudomilitaris Hywel – Jones & Sivichai, 1994 vùng núi Langbian Đà Lạt, Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3B): p 1507 – 1511 [7] Phạm Quang Thu, (2009), Điều tra phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps nutans pat phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang Tạp trí nơng nghiệp phát triển nông thôn [8] Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, and Nguyễn Mạnh Hà, Nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam [9] Trần Ngọc Lân (2008) Đa dạng sinh học nấm ký sinh côn trùng Vườn Quốc gia Pù Mát đánh giá khả ký sinh số loài nấm số loài sâu hại trồng Đề tài cấp Giáo dục & Đào tạo Mã số: B2007 - 27 - 25 [10] Trần Thùy Hương, Nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Viện Bảo vệ thực vật 71 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan [11] Võ Thị Hạnh, Lê Tấn Hưng, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thạnh Phong, Trương Thị Hồng Vân, Sivichai, S., (2010), Nấm côn trùng vườn quốc gia Cát Tiên: Nguồn tài nguyên quý cho ứng dụng sinh học Tuyển tập Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm thành lập Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam, p 109-118 Tài liệu tham khảo tiếng anh: [12] Baldwin, B G., Sanderson M.J., Porter J M., Wojciechowski M F., Campbell C S., and Donoghue M J., 1995 The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny Annals of the Missouri Botanical Garden 82: 247-277 [13] Berbee, M L., Yoshimura A., Sugiyama J W., 1995 Is Penicillium monophyletic an evaluation of phylogeny in the family Trichocomaceae from 18S, 5.8S and ITS ribosomal sequence data Mycologia 87: 210-222 [14] Chao Kang, Wen, T.-C, et al., Optimization of large-scale culture conditions for the production of cordycepin with Cordyceps militaris by liquid static culture [15] Chen L.T., Cao H.F & Huang W.F (2005) Components, pharmacological activities and application of Cordyceps militaris, Modern Food Science 21(3), 192-195 [16] Chen, R L C., Wang, z S and Yang, J P,(1998), Determination of adenosine and cordycepin contents in cultivated Cordyceps by micellar electrokinetic capillary chromatography Taiwan Sugar Res 161: p 4956 [17] Derringer G., Suich R (1980), Simultaneous optimization of several responses variables, Journal of quality technology 12 (4) 214-219 [18] Design- Expert version 8.0.6 – Software for design of experiments, Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA, 2007 [19] Doctoral thesis (2009) Production of anti- cancer agent cordycepin from the medicinal mushroom Cordyceps militais A Dissertation Submitted to the University of Fukui for the Degree of Doctor of Engineering Japan 72 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan [20] Hui – juan L, Hao-bin H, Chu C, Qin L, (2011) Morphological and microscopic identification studies of Cordyceps and its counterfeits Acta Pharmaceutica Sinica B, (3): 189-195 [21] Ing-Lung Shih, Kun-Lin Tsai, and Chienyan Hsieh Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactivemetabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris Biochemical Enginneering journal, 2006 [22] John H, Matt C, Aloha M Inc, SantaCruz, California, U.S.A (2005) Cordyceps Wasser SP Institute of Evolution, University of Haifa, Mt.Carmel, Haifa, Israel [23] Kim S W, Hwang, H.L, Xu, C.P, Sung, J.W, (2003), Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by Cordyceps militaris C738 Journal of Applied Microbiology, (94): p 120-126 [24] Khan A, Tania, M, Zhang D.Z, Chen, H.C (2010), Cordyceps Mushroom: A Potent Anticancer Nutraceutical The Open Nutraceuticals Journa, (3): p 179183 [25] Lei Huang, Qizhang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang & Xuanwei Zhou, (2009) Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the product s of Cordyceps spp 957-961 December [26] Lo HC, Chienyan H, Fang YL anh Hsu TH, (2013), A systematic review of the mysterious caterpillar fungus OphioCordyceps sinensis in DongchongXiaXao and Related Bioactive ingredients, Journal of Traditional and Complementary Medicine 3(1):p 16-32 [27] Lu LX, Xu Q, Liu ZH, Sun Y, Djing Z, Li YQ (2012) Optimization for Production of Intracellular Polysaccharides from Cordyceps ophioglossoides L2 in Submerged Culture and Its Activities invitro Chinese Journal of Chemical Engineering 20(2):294-301 73 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan [28] Mao X Ying J, Ma Q, Wen H, (1987) Icons of medicinal mushroom from China Science Press Beijing: p 151-155 [29] Matt Cleaver John Holliday, (2008) Medicinal Value of the Caterpillar Fungi Species of the Genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) A Review International Journal of Medicinal Mushrooms, 10(3): p 219–234 [30] Mina Masuda, et al., Production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris Enzyme and microbial technology, 2005 [31] Nigel L Hywel-Jones Gi-Ho Sung, Jae-Mo Sung, J Jennifer Luangsa-ard, Bhushan Shrestha and Joseph W Spatafora, (2007), Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi Studies in Mycology 57: p 5-59 [32] Seok KJ, Lê JS, Shin CW, Lee KE, and Hong EK Korea (2009) Optimization of Culture Conditions and Medium Components for the Production of Mycelial Biomass and Exo-polysaccharides with Cordyceps militaris in Liquid Culture Biotechnology and Bioprocess Engineering 14:756-762 [32] Shonkor Kumar Das, (2009), Production of anti-cancer agent cordycepin from the medicinal mushroom Cordyceps militaris The University of Fukui [34] Shonkor Kumar Das, Shinya Fujihara, and Mina MASUDA and Akihiko SAKURAI, (2010), Efficient Production of Anticancer Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris Mutant Proceedings of the World Congress on Engineering and Computer Science 2010 II [35] Want Z S Gu Y X, Li S X, Yuan Q S, ( 2007), Effects of multiple factors on accumulation of nucleosides and bases in Cordyceps militaris Food Chem 102: p 1304-1309 [36] Yongliang Xia Peng Zheng, Guohua Xiao, Chenghui Xiong, Xiao Hu, Siwei Zhang, Huajun Zheng, Yin Huang, Yan Zhou, Shengyue Wang, Guo-Ping Zhao, Xingzhong Liu, Raymond J St Leger and Chengshu Wang, (2011) Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional chinese medicine Genome Biology, 12 74 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan [37] Xuanwei Zhoua, Zhenghua Gonga, Ying Sua, Juan Linb and Kexuan Tang,(2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products Journal of Pharmacy and Pharmacology: 61(3):279-91 [38] Hardeep Singh Tuli, Anil K Sharma, Sardul Singh Sandhu, (2014) Optimization of ferrmentation conditions forr cordycepin production using Cordyceps militaris 3936 Journal of Biological and Chemical Sciences (JBCS): boI.1, no 1, 35-47 Trang web: [39] Chang Gung Biotechnology Available from: http://www.cgb.com.tw/j2j0/cus/cus2/rd/rd_main_3_6.jsp [40] Joey Spatafora Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link 1818 Available from: http://cordyceps.us/node/5671 75 ... quả, số liệu nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày tháng Lưu Thị Lan năm 2015 Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan BẢNG CÁC THUẬT NGỮ VIẾT... giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Lưu Thị Lan LỜI CAM ĐOAN Tôi Lưu Thị Lan xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tôi, hướng dẫn... phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC Luận văn thạc sỹ khoa học Lưu Thị Lan CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo nhà khoa học Trung Quốc xác định đầu xuất