Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là một số vi khuẩn gây ô nhiễm trong thịt đông lạnh nhập khẩu (quy định trong QCVN 8-3/ BYT) và các tiêu chuẩn sử dụng để xét nghiệm
- Salmonella spp – TCCS 03/TYV2/2016-CĐ
Phòng Vi sinh thực phẩm - Tổ Vệ sinh thú y - Trạm Chẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật, Cơ quan Thú y vùng II
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 8/2016 đến tháng 6/2017.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp
- Thẩm định phương pháp đinh lượng tổng số VSVHK trong thịt theo TCVN 9977-2013
- Thẩm định phương pháp đinh lượng vi khuẩn E.coli trong thịt theo TCVN 9975-2013
- Thẩm định (xác nhận giá trị sử dụng) phương pháp phát hiện Salmonella spp trong thịt theo TCCS 03/2016/TYV2-CĐ
3.2.2 Ứng dụng Kiểm nghiệm một số mẫu thịt đông lạnh nhập khẩu
- Kiểm nghiệm các lô thịt bò đông lạnh
- Kiểm nghiệm các lô thịt đùi gà đông lạnh
- Kiểm nghiệm các lô thịt gà nguyên con đông lạnh
Nguyên liệu
3.3.1 Chủng chuẩn vi sinh vật
- Salmonella enterica subsp enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™*,
- Staphylococus aureus subsp aureus ATCC ® 29213 TM
3.3.2 Các mâũ thịt đông lạnh:
Các mẫu thịt đông lạnh nhập khẩu đủ điều kiện cho xét nghiệm phải được đóng gói và niêm phong cẩn thận, đồng thời được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 độ C khi tiếp nhận tại phòng xét nghiệm vi sinh Những mẫu này bao gồm thịt gà xay, thịt bò, gà nguyên con và đùi gà.
3.3.3 Các thiết bị trong phòng thí nghiệm
- Tủ âm sâu(-20 0 C), tủ ấm các loại, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp cách thủy, cân, buồng cấy an toàn sinh học, máy dập mẫu stomatcher
Ống lưu giữ chủng chuẩn thương mại Microbank, đèn cồn, que cấy nhựa vô trùng dùng một lần, hộp lồng thủy tinh, khay men, cốc đong, ống nghiệm, dao mổ và kéo cong là những dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm, phục vụ cho việc bảo quản mẫu và thực hiện các thí nghiệm một cách hiệu quả.
- Hệ thống định danh Vitek 2 compact
3.3.4 Môi trường chính nuôi cấy vi sinh vật
Bảng 3.1 Môi trường chính dùng để thẩm định phương pháp và phân tích các chỉ tiêu VSV
TT Chỉ tiêu phân tích/Phương pháp
(TCVN9977:2013) Đĩa đếm vi sinh vật hiếu khí 3M Petrifilm TM Aerobic count plate
2 E.coli (TCVN9975:2013) Đĩa đếm 3M Petrifilm TM E coli/coliform count plate
Buffer peptone water (BPW), Iris Salmonella supplement(BS 07708), Iris Salmonella agar, confirm’ Salmonella (BT01108)
MKTTn - Tetrathionat/novobioxin Muller kauffman, RVS - Rappaport Vassiliadis, thạch XLD -
Deoxycholat lyzin xyloza, HE - Hektoen enteric agar, TSA (Tryp Soy agar), và KHT O, H đa giá là những môi trường nuôi cấy vi sinh vật quan trọng Đĩa đếm vi sinh vật hiếu khí Petrifilm TM có màng nền chứa thạch và chất tạo đông tan trong nước lạnh, với màng phủ chứa chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua giúp quan sát sự phát triển của khuẩn lạc dễ dàng Mỗi đĩa có khoảng hai mươi ô vuông, mỗi ô có diện tích 1 cm² Đĩa đếm E coli/coliform Petrifilm TM chứa các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím, chất tạo đông, và chất chỉ thị glucuronidase 5-brom-4-clo-3-indolyl-ò-D-glucuronid, cho phép đếm coliform và E coli trên cùng một đĩa, với vùng sinh trưởng cũng được khoanh tròn tương tự.
Agar Salmonella IRIS là môi trường chọn lọc với độ nhạy cao trong việc phát hiện hầu hết các loại Salmonella, bao gồm cả các serovar không điển hình Môi trường này cho phép xác định Salmonella typhi và paratyphi, cũng như các loài Salmonella dương tính với lactose như Salmonella Senftenberg và các phân loài S arizonae, S diarizonae Ngoài ra, agar cũng phát hiện các serovar bất động như S Pullorum và S Gallinarum, cùng với các chủng đơn IRIS® Salmonella Agar còn có khả năng phát hiện các dòng Salmonella có ít hoặc không có hoạt tính esterase trên các môi trường khác, bao gồm Salmonella bongori, Salmonella Dublin và một số phân loài S houtenae và S diarizonae.
MKTTn và RVS là các môi trường tăng sinh thứ cấp, trong đó có một số thành phần có khả năng ức chế các loài vi khuẩn không phải Salmonella XLD agar và HE agar được sử dụng như các môi trường chọn lọc để phát hiện sự hiện diện của Salmonella.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp thẩm định tiêu chuẩn
Thẩm định, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp thử nghiệm được thực hiện theo:
- Trần Cao Sơn 2010, TCVN 9332:2012 Các thông số cần xác định:
Độ lặp lại và độ tái lặp là những yếu tố quan trọng trong phương pháp định lượng, trong khi giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu và độ đúng là các chỉ số cần thiết cho phương pháp định tính Để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của các phương pháp này, cần thực hiện các bước thẩm định phương pháp một cách bài bản.
Đánh giá môi trường nuôi cấy trong các phương pháp xét nghiệm là rất quan trọng Theo tiêu chuẩn TCVN 8128: 2015, việc đánh giá hiệu suất của môi trường nuôi cấy dạng đặc được thực hiện để xác định hiệu suất môi trường, được ký hiệu là P R %.
P R: Hiệu suất môi trường đánh giá
N S: Số khuẩn lạc trung bình trên môi trường kiểm tra
Số khuẩn lạc trung bình trên môi trường tham chiếu phải lớn hơn 100 Để thực hiện, lấy một hạt giá thể chứa chủng chuẩn Salmonella enteritidis ATCC®49223™ và Escherichia coli ATCC® 11303™ đã được hoạt hóa, bảo quản ở -20°C trong các ống Microbank Tiến hành tăng sinh trong môi trường Brain Heart Infusion ở 37°C trong 24 giờ Sau đó, ria cấy chủng từ các ống tăng sinh lên các môi trường TSA và ủ ở 37°C trong 18-24 giờ Thực hiện các bước pha loãng và cấy lên các môi trường khác nhau.
- Môi trường dùng để kiểm tổng số VSVHK 3M TM Petrifilm TM Aerobic count plate với môi trường dinh dưỡng Plate count agar (PCA)
- Môi trường dùng để kiểm Coliform và E.coli 3M TM Petrifilm TM E.coli/Coliform count plate với môi trường Plate count agar (PCA)
- Môi trường Iris Salmonella agar với môi trường Tryptic Soy agar (TSA) B2: Kiểm tra nền mẫu
Đối với các mẫu nhiễm tự nhiên (mẫu dương tính), việc kiểm tra tính ổn định của mẫu là rất quan trọng Các vi sinh vật mục tiêu có trong nền mẫu cần phải duy trì tính ổn định qua các lần kiểm tra để đảm bảo độ chính xác của kết quả.
Để đảm bảo độ chính xác trong các phương pháp phân tích định tính, các nền mẫu cần được kiểm tra không có vi sinh vật mục tiêu, tức là mẫu âm tính Cụ thể, cần lấy riêng 1 kg thịt bò và 1 kg thịt gà xay cắt nhỏ, sau đó đồng nhất từng nền mẫu Từ mỗi nền mẫu, rút ra 5 mẫu với mỗi mẫu có trọng lượng 25g.
Kiểm tra tổng VSVHK theo TCVN 4884-1: 2015
Kiểm tra E.coli trong các nền mẫu theo TCVN 7924-2: 2008
Kiểm tra Salmonella trong các nền mẫu theo TCVN 4829: 2005
B3: Kiểm tra chủng chuẩn phục vụ cho việc gây nhiễm
Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng gây nhiễm là cần thiết để đảm bảo các chủng chuẩn không bị biến đổi trong quá trình lưu giữ và bảo quản Đề tài này sử dụng hệ thống định danh vi khuẩn Vitek 2 để thực hiện việc kiểm tra chủng, với các bước chi tiết được trình bày trong phụ lục 1.
Trước khi tiến hành gây nhiễm chủng vào mẫu, các chủng bao gồm
The identification of Salmonella enterica subsp enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™, Escherichia coli ATCC® 11303™, Vibrio parahaemolyticus ATCC® 17802™, and Staphylococcus aureus subsp aureus ATCC® 29213™ was performed using the Vitek2 identification system.
Sau khi định danh hai chủng Salmonella enterica subsp enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™ và Escherichia coli ATCC® 11303™, chúng tôi đã so sánh với giấy chứng nhận sinh học từ nhà cung cấp để kiểm tra tính tương đồng của các phản ứng sinh hóa.
Chủng vi khuẩn gây nhiễm có thể được nhận diện qua các đặc tính nuôi cấy trên môi trường chọn lọc chuyên biệt, chẳng hạn như khả năng sinh hơi, lên men trong môi trường lỏng hoặc khả năng tạo màu trên các môi trường này.
B4: Xác định mật độ vi khuẩn để phục vụ cho việc gây nhiễm vào mẫu thẩm định
Sử dụng phương pháp xác định nồng độ vi sinh vật mục tiêu trong các ống pha loãng từ 10 0 , 10 -1 ….10 -n bằng cách thăm dò từng ống trong dãy pha loãng:
Để thực hiện, lấy một khuẩn lạc của chủng E.coli hoặc Salmonella đã được kiểm tra đặc tính sinh hóa và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, sau đó hòa loãng trong 9ml buffer peptone water để tạo dịch canh khuẩn có nồng độ thích hợp.
10 0 , chuyển 1ml sang ống chứa 9ml buffer peptone water được ống có nồng độ
10 -1 , thực hiện liên tiếp đến nồng độ 10 -7 , 10 -8
Xác định nồng độ vi khuẩn trong canh trùng được thực hiện bằng phương pháp cấy trang trên đĩa thạch theo TCVN 4884-2:2015 Quy trình sử dụng Micropipep để lấy 0,1ml mẫu và cấy láng lên mặt thạch, có thể là môi trường dinh dưỡng TSA hoặc môi trường chọn lọc cho vi sinh vật mục tiêu Đối với phương pháp đổ đĩa, 1ml mẫu sẽ được sử dụng Quá trình này cần được lặp lại cho mỗi độ pha loãng để đảm bảo độ chính xác trong kết quả.
Nuôi cấy mẫu trong tủ ấm theo các điều kiện nhiệt độ và thời gian quy định, sử dụng hai nồng độ liên tiếp để tính toán kết quả Kết quả được xác định dựa trên tiêu chuẩn TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007).
B5 Gây nhiễm vi sinh vật vào các mẫu
Với phương pháp định lượng:
Sử dụng vi sinh vật hoặc mẫu nhiễm tự nhiên là phương pháp hiệu quả để thực hiện các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm Điều này giúp đảm bảo rằng các mẫu xét nghiệm nằm trong khoảng phát hiện tối ưu, từ đó nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.
Mỗi ngày, thực hiện gây nhiễm ít nhất 10 mẫu nghiên cứu cho mỗi nền mẫu, bao gồm 10 mẫu thịt gà xay và 10 mẫu thịt bò Mỗi mẫu nặng 50g sẽ được gây nhiễm với một lượng vi khuẩn E.coli trong khoảng nồng độ từ 10² đến 10⁴ CFU/g.
Phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí (VSVHK) được thực hiện theo TCVN 9977:2013 và TCVN 4884:2015 trên 20 mẫu thịt xay, bao gồm 10 mẫu nhiễm tự nhiên và 10 mẫu thịt bò nhiễm chủng E.coli Đối với các mẫu thịt bò, do số lượng vi sinh vật thấp, cần phải bổ sung một lượng vi khuẩn nhất định Cụ thể, chủng E.coli được sử dụng để gây nhiễm với mức khoảng 7*10² CFU/g cho 50g mẫu, tương đương với 2ml dịch canh khuẩn từ ống pha loãng 10^-4 Quá trình này được thực hiện 10 lần với 10 mẫu lặp lại trong 2 ngày liên tiếp.
Thực hiện thẩm định phương pháp định lượng E.coli theo TCVN 9975:
