(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––––– XAYKHAM THIPPHAVONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O-METHYLTRANSFERASE (CoOMT) VÀO CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2021 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––––– XAYKHAM THIPPHAVONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O-METHYLTRANSFERASE (CoOMT) VÀO CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) Ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 8420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : TS PHẠM THỊ THANH NHÀN THÁI NGUYÊN - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme columbamine o-methyltransferase (CoOMT) vào thuốc (Nicotiana tabacum L.)” cơng trình nghiên cứu riêng tơi Tơi tự tiến hành bước thí nghiệm, thu kết viết thành luận văn hướng dẫn trực tiếp TS Phạm Thị Thanh Nhàn Mọi kết thu trung thực, không chép từ kết nghiên cứu khác Tất tham khảo kế thừa trích dẫn đầy đủ Thái Nguyên, tháng năm 2021 Tác giả luận văn Xaykham THIPPHAVONG i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn phủ hai nước Lào Việt Nam dành cho học bổng học tập, để tơi bước chân vào học tập nghiên cứu Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thanh Nhàn, người tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn thầy cô cán Khoa Sinh học, phận Sau đại học Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên trang bị cho kiến thức, kinh nghiệm quý giá môn học liên quan đến chuyên ngành tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Tơi xin cảm ơn tồn thể đồng nghiệp, gia đình, bạn bè động viên, giúp em vượt qua khó khăn suốt thời gian học tập, nghiên cứu sinh sống Thái Nguyên, Việt Nam Mặc dù cố gắng nhiều thời gian thực đề tài luận văn lực kinh nghiệm hạn chế, em mong nhận ý kiến nhận xét quý thầy cô để luận văn em hoàn thiện Thái Nguyên, tháng năm 2021 Tác giả luận văn Xaykham THIPPHAVONG ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Những chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học đề tài CHƢƠNG 1: T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Giới thiệu mơ hình 1.2 Hợp chất rotundin enzyme Columbamine O-methyltransferase 1.2.1 Hợp chất rotundin 1.2.2 Enzyme Columbamine O- methyltransferase 1.3 Kỹ thuật chuyển gen thực vật ứng dụng cải thiện hàm lượng dược chất thuốc 1.3.1 Phương pháp chuyển gen thực vật 1.3.2 Kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thực vật 10 1.3.3 Phân tích có mặt gen chuyển chuyển gen 12 CHƢƠNG 2: VẬT LI U VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu nguyên cứu 19 2.1.1 Vật liệu thực vật 19 2.1.2 Chủng vi khuẩn 19 2.1.3 Hóa chất thiết bị 19 iii 2.2 Địa điểm nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp chuyển gen vào thuốc 22 2.3.2 Phương pháp phân tích chuyển gen 24 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết chuyển gen CoOMT vào thuốc 28 3.1.2 Kết nuôi hoạt hóa vi khuẩn A tumefaciens AGL1 chứa vector chuyển gen CoOMT 28 3.1.3 Kết biến nạp gen CoOMT vào thuốc 28 3.2 Kết phân tích biểu gen chuyển thuốc mức độ phiên mã 31 3.2.1 Kết xác định có mặt gen chuyển CoOMT thuốc chuyển gen 31 3.2.2 Kết phân tích biểu gene CoOMT phản ứng semiquantitative PCR (semi- qPCR) 34 3.2.3 Thảo luận kết đánh giá hoạt động vector chuyển gen pBI121-1113 - CoOMT 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LI U THAM KHẢO 39 iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt CoOMT Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Columbamine O- Gen mã hóa tổng hợp Methyltranferase L-tetrahydropalmatin Cộng Cs Deoxynucleoside Nucletide tổng hợp dùng Triphosphate phản ứng PCR Ethylene diamine tetraacetic Axit hữu dùng để khử hoạt acid tính enzyme LB Luria Bertani Mơi trường ni cấy vi khuẩn MS Murashige - Skoog Môi trường nuôi OD Optical density Mật độ vi khuẩn PCR Polymerase Chain Reaction Phán ứng chuỗi Polymerase Polymerase Chain Reaction Phán ứng chuỗi tổng hợp Reverse Transcription PCR cDNA từ mRNA RM Rooting medium Môi trường tạo rễ SEM Shoot elongation medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium Môi trường tạo đa chồi TAE Tris - Acetate - EDTA Dung dịch đệm điện di DNA dNTP EDTA RT-PCR iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần loại môi trường tái sinh thuốc 20 Bảng 2.2 Cặp mồi đặc trưng phản ứng RT-PCR 25 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.4 Thông tin trình tự mồi phản ứng semi- qPCR qRT-PCR 27 Bảng 3.1 Kết biến nạp vector mang gen CoOMT vào thuốc 30 Bảng 3.2 Kết định lượng RNA tổng số tách chiết từ thuốc WT chuyển gen 32 v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây thuốc Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo palmatin L-tetrahydropalmatin [50] Hình 1.3 Con đường tổng hợp tetrahydropalmatine palmatine [34] Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid [43] 11 Hình 1.5 Sự tương tác Agrobacterium chế chuyển T-DNA sang tế bào thực vật [36] 12 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector biểu pBI121 [20] 19 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 21 Hình 3.1 Hình ảnh biến nạp di truyền vào thuốc 29 Hình 3.2 Một thuốc chuyển gen nhà lưới 31 Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ thuốc WT chuyển gen hệ T0 32 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR xác định có mặt gen chuyển CoOMT thuốc chuyển gen hệ T0 33 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm semi-qPCR phân tích biểu gen chuyển CoOMT thuốc chuyển gen đối chứng 34 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Thực vật nguồn có giá trị cung cấp chất chuyển hóa thứ cấp steroid, alkaloids, flavonoid, terpenoid, anthocyanon, quinin lignan Các hợp chất sử dùng làm dược liệu, hương liệu, hóa chất, thuốc nhuộm, nước hoa phụ gia có giá trị cao Tổng số khoảng 30.000 sản phẩm tự nhiên biết đến có 80% có nguồn gốc từ thực vật Những sản phẩm biết hợp chất trao đổi thứ cấp, thường tổng hợp với lượng nhỏ alkaloid loại L-tetrahydropalmatin (rotundin) Rotundin dược liệu áp dụng điều trị số trường hợp đau tim, ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt gây ngủ an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có ưu điểm bật độc tính thấp, dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý Sau ngủ không bị mệt mỏi không gây nhức đầu loại thuốc tổng hợp từ hoá chất Columbamine O-Methyltransferase (CoOMT) phát enzyme làm chìa khóa chuỗi chuyển hóa tổng hợp rotundin thuộc Mao lương (Rannunculaceae) Biểu mạnh gen mã hóa enzyme CoOMT làm tăng sản phẩm chuyển hóa thứ cấp hàm lượng rotundin chuyển gen Cây thuốc (Nicotiana tabacum L.) loài thuộc họ Cà (Solanaceae) loại sử dụng làm mơ hình phổ biến để biểu gen chuyển từ nhiều loại sinh vật, dễ trồng dễ dàng biến đổi gen Nó cung cấp lượng mơ sống đáng kể có hệ thống ni cấy tế bào thiết lập tốt Enzyme vi khuẩn tổng hợp thuốc tăng cường bảo vệ, chống lại stress phi sinh học mầm bệnh Thuốc sử dụng mơ hình cho tính nhạy cảm với bệnh thực vật, sinh tổng hợp pyridine alkaloid (như nicotine), stress oxy hóa… A: Mảnh thuốc ngâm dịch khuẩn AGL1 ; B: Mảnh thuốc môi trường đồng nuôi cấy ; C: Các mảnh cảm ứng tạo đa chồi môi trường SIM tuần ; D: Chồi sinh trương môi trường SIM ; E : Các chồi tái sinh môi trường SEM tuần ; F, G : Cây tạo rễ môi trường RM ; H: hoàn chỉnh Kết chuyển cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT vào giống thuốc mơ hình giống K326 lần biến nạp với 150 mẫu 60 mẫu đối chứng Đối với mẫu biến nạp 150 mẫu qua bước từ biến nạp gen, đồng nuôi cấy, tạo chồi, tái sinh chồi, tạo hoàn chỉnh đưa trồng giá thể trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết biến nạp vector mang gen CoOMT vào thuốc Đối chứng Số mẫu thí nghiệm biến nạp cụm chồi ĐC1 30 ĐC0 Thí nghiệm Tổng Số mẫu tạo Số chồi Số Số trồng tái sinh rễ giá thể 19 52 31 17 30 0 0 50 14 25 14 50 33 72 40 17 50 22 55 30 15 150 69 152 84 41 Ghi chú: ĐC1 mầm thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh; ĐC0 thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh Trên bảng cho thấy với 150 mẫu cây, sau ba lần biến nạp thu 69 mẫu tạo cụm chồi có 152 mẫu chồi tái sinh môi trường chọn lọc MS chứa cefotaxime, kanamycin có 84 mẫu rễ, 41 giá Trong ĐC0 30 mẫu khơng chuyển gen ni mơi trường chọn lọc kháng sinh khơng xuất mẫu tạo chồi, ĐC1 có 19 mẫu chồi, 52 chồi kéo dài, 31 chồi rễ, đem 17 trồng giá thể bảng 3.1 30 Hiệu suất chuyển gen giai đoạn 27,3 % Kết phù hợp với cơng trình công bố trước [3], [26], [33], [37] Về nguyên lý khoa học, cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT (pBI121-1113 - CoOMT) thiết kế mang thêm gen thị kháng sinh Do vậy, mẫu nhận cấu trúc có khả sống sót, sinh trưởng phát triển tốt mơi trường ni cấy có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycine Những mẫu không nhận cấu trúc chuyển gen đối chứng khơng có khả sinh trưởng phát triển tốt mơi trường ni cấy có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycine tạo kiểu hình phát triển (màu ngày ngà vàng, kích thước mẫu nhỏ, xoăn dị dạng ), nuôi cấy thời gian dài mẫu chết Hình 3.2 Một thuốc chuyển gen nhà lƣới 3.2 Kết phân tích biểu gen chuyển thuốc mức độ phiên mã 3.2.1 Kết xác định có mặt gen chuyển CoOMT thuốc chuyển gen Mẫu từ 01 WT 06 số 41 thuốc chuyển gen hệ T0 (T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20) có đặc điểm sinh trưởng, phát triển tốt nhà lưới sử dụng để tách chiết RNA tổng số Trizol™ Reagent Các mẫu dịch chiết RNA tổng số định lượng máy Nanodrop (Bảng 3.2) Kết bảng 3.2 cho thấy dịch chiết RNA tổng số 01 mẫu thuốc WT 06 thuốc chuyển gen có tỉ số 31 A260/A280 dao động từ 1,92- 1,96, đảm bảo độ tính hàm lượng tốt cho phản ứng phân tích phân tử (nồng độ dao động từ 425- 793 ng/ ) Bảng 3.2 Kết định lƣợng RNA tổng số tách chiết từ thuốc WT chuyển gen STT Mẫu/Dòng Tỉ số A260/A280 Nồng độ (ng/ ) WT 1,93 505,3 1,96 793,9 1,93 500,0 1,92 435,0 1,99 1038,0 10 1,93 425,0 20 1,95 639,6 Khoảng 1,5 g RNA kiểm tra điện di gel agarose 1.2% (Hình 3.3) Kết điện di cho thấy RNA tổng số thu đảm bảo chất lượng độ tinh để thực phản ứng phân tích có mặt gen chuyển phản ứng semi-qPCR đánh giá mức độ phiên mã, hoạt động cấu trúc vector chuyển gen thơng qua phản ứng realtime RT-PCR (hay qRT-PCR) Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ thuốc WT chuyển gen hệ T0 (WT: RNA tách chiết từ Wild type- thuốc không chuyển gen; 6, 7, 8, 9,10, 20: RNA tách chiết từ dòng thuốc chuyển gen) 32 Xác định có mặt gen chuyển CoOMT thuốc chuyển gen kỹ thuật RT- PCR với cặp mồi RT_Fw/RT-Rv khuếch đại tồn trình tự cDNA-Cmyc- kdel trình tự nhận biết RE hai đầu, kích thước sản phẩm dự kiến khoảng 1,2 kb (Hình 3.4 A) Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR hình 3.4 A cho thấy 06 chuyển gen dương tính (T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20), WT không xuất không chuyển cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT Để xác định chất lượng cDNA tổng hợp khẳng định kết xác định có mặt gen chuyển xác, tiếp tục thực phản ứng RT-PCR với cặp mồi 18S (Hình 3.4 B) Kết hình 3.4 A 3.4 B hoàn toàn trùng khớp Như bước đầu nhận xét gen chuyển CoOMT có mặt hệ gen thuốc chuyển gen hệ T0 (T0-6, T07, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20) (A) (B) Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR xác định có mặt gen chuyển CoOMT thuốc chuyển gen hệ T0 (M: thang DNA kb; WT: sản phẩm nhân gen CoOMT từ Wild type- thuốc không chuyển gen; 6, 7, 8, 9,10, 20: sản phẩm nhân gen CoOMT từ dòng thuốc chuyển gen; (-): Đối chứng âm) A: Sản phẩm RT-PCR gen CoOMT ; B: Sản phẩm RT-PCR đoạn gen 18S 33 3.2.2 Kết phân tích biểu gene CoOMT phản ứng semiquantitative PCR (semi- qPCR) Để đánh giá hiệu hoạt động cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT thuốc chuyển gen làm sở để chuyển cấu trúc vào Bình vơi, nhằm nâng cao hàm lượng dược chất có hoạt tính rotundin, RNA tổng số WT 06 dòng thuốc chuyển gen hệ T0 (T0-6, T0-7, T08, T0-9, T0-10, T0-20) tiếp tục sử dụng để phân tích mức độ biểu gen chuyển CoOMT mức phiên mã phản ứng semi-qPCR Kết phản ứng semi-qPCR vừa sở để đánh giá định tính mức độ phiên mã, vừa khảo sát tính đặc hiệu hai cặp mồi ActNF/ ActNR gen Actin COMT-qF/ COMT-qR gen CoOMT thực phản ứng qRTPCR định lượng xác mức độ phiên mã gen Kết semi-qPCR thể hình 3.5 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm semi-qPCR phân tích biểu gen chuyển CoOMT thuốc chuyển gen đối chứng (WT: sản phẩm nhân gen CoOMT từ Wild type- thuốc không chuyển gen; 6, 7, 8, 9,10, 20: sản phẩm nhân gen CoOMT từ dòng thuốc chuyển gen) 34 Từ kết thể hình 3.5, band sản phẩm phản ứng semi-qPCR gen tham chiếu Actin 01 mẫu WT 06 mẫu chuyển gen hệ T0 (T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20) tương đối Điều cho thấy mức độ phiên mã gen Actin ở điều kiện, với lý thuyết gen tham chiếu (house-keeping gene) Trong đó, gen chuyển CoOMT biểu chuyển gen, không biểu WT Ở 26 chu kì, phiên mã gen chuyển CoOMT chuyển gen thấp Khi lên 28 chu kì, phiên mã gen chuyển CoOMT chuyển gen mạnh gen tham chiếu Actin 30 chu kì Các band sản phẩm phản ứng semi-qPCR gen CoOMT có kích thước to rõ nét band sản phẩm phản ứng semi-qPCR gen tham chiếu Actin mẫu chuyển gen hệ T0 Kết bước đầu chứng tỏ cấu trúc vector chuyển gen mang gen chuyển CoOMT hoạt động tốt mức độ phiên mã Gen đích biểu mạnh nhờ promoter có vector Từ kết này, lựa chọn RNA tổng số mẫu WT, mẫu T0-07, T0-09, T0-20 làm đại diện cho mức độ phiên mã khác (đối chứng- WT, biểu thấp, biểu cao) để định lượng xác mức độ phiên mã phản ứng qRT-PCR với cặp mồi ActNF/ ActNR gen Actin COMT-qF/ COMT-qR gen CoOMT thiết kế kiểm tra phản ứng semi-qPCR Kết qRT-PCR minh chứng khẳng định cấu trúc chuyển gen pBI121-1113 – CoOMT hoạt động tốt mơ hình, chuyển vào đích để phân tích chức gen việc cải thiện hàm lượng dược chất rotundin alkaloid 3.2.3 Thảo luận kết đánh giá hoạt động vector chuyển gen pBI121-1113 - CoOMT Vector pBI121-1113 - CoOMT thiết kế chứa cấu trúc 35S-CoOMTcmyc-KDEL-polyA, gen nptII kháng Karnamycine số thành phần khác Tập hợp thành phần cấu trúc nằm bờ trái (Left Border - LB) bờ phải (Righ Border - RB) vector thiết kế bảo đảm cho gen đích hoạt động 35 dễ dàng sàng lọc thể tái tổ hợp Promoter 35S promoter mạnh phân lập từ virus gây bệnh khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus - CaMV), khởi động phiên mã cho gen tất loại mô bào thực vật giai đoạn sinh trưởng phát triển Trong nghiên cứu này, thiết kế vector chuyển gen pBI121, promoter CaMV35S sử dụng hướng đến việc khởi động phiên mã gen chuyển CoOMT nhằm tăng cường sinh tổng hợp rotundin, palmatin Bình vơi Một số nghiên cứu gần chuyển gen thực vật sử dụng promoter CaMV35S cấu trúc vector chuyển gen thu kết biểu gen chuyển khả quan thông qua phân tích Western blot ELISA Promoter CaMV35S vector chuyển gen pCB301-GmEXP1 tăng cường biểu gen chuyển GmEXP1 thuốc chuyển gen xác nhận kết phân tích Real-time RT-PCR Western blot [33] Sự biểu mạnh gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB2 vector pBI121GmDREB2 chứa promoter CaMV35S minh chứng kết biểu protein tái tổ hợp GmDREB2 tác động tăng cường tổng hợp proline chuyển gen điều kiện gây hạn nhân tạo [37] Theo hướng tạo chuyển gen kháng virus theo chế RNAi, Lo Thi Mai Thu cs (2016) sử dụng promoter CaMV35S vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi pK7GW-CPi (SMV-BYMV) Kết phân tích thuốc chuyển gen Real-time RT-PCR chứng minh điều khiển phiên mã CaMV35S cấu trúc RNAi [25] Kế thừa kết nghiên cứu trước, vector chuyển gen pBI121- CoOMT chứa promoter CaMV35S thiết kế nhằm biểu mạnh gen CoOMT thí nghiệm chuyển gen thuốc Bình vơi, làm sáng tỏ chức gen trình sinh tổng hợp rotundin alkaloid Theo kết nghiên cứu Bùi Thị Hà cộng (2018), sau lần biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào mảnh thuốc giống K326, 235/ 249 mảnh sống sót sau tuần, phát sinh 205 chồi thu 186 in 36 vitro sống sót mơi trường MS có bổ sung kháng sinh Số bầu đất 113 có 65 trồng nhà lưới có biểu xanh tốt, mập mạp (hiệu suất chuyển gen giai đoạn 26,1%) Kết phân tích PCR, Southern blot Western blot dòng thuốc chuyển gen CrDAT hệ T0 chứng minh gen chuyển CrDAT hợp vào hệ gen thuốc chuyển gen gen chuyển CrDAT hoạt động phiên mã dịch mã cho kết biểu protein tái tổ hợp CrDAT [3] Như vậy, nghiên cứu đề tài này, hiệu suất chuyển gen giai đoạn chọn lọc thuốc chuyển gen kháng sinh chọn lọc 27,3% Kết phù hợp với cơng trình công bố trước Kết bước đầu phân tích chuyển gen xác định có mặt gen chuyển CoOMT phản ứng RT-PCR, xác định tính mức độ phiên mã gen chuyển CoOMT phản ứng qPCR có tín hiệu khả quan để khẳng định cấu trúc chuyển gen pBI121-1113 - CoOMT hoạt động tốt mơ hình, tiếp tục chuyển vào đích 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Cấu trúc mang gen chuyển CoOMT biến nạp thành công vào thuốc Từ 150 mẫu biến nạp thu 69 mẫu tạo cụm chồi có 152 mẫu chồi tái sinh môi trường chọn lọc MS chứa cefotaxime 50 mg/l, kanamycin 50 mg/l, có 84 mẫu rễ, 41 sống giá thể (hiệu suất chuyển gen 27,3 %) 1.2 Bằng phản ứng RT-PCR xác định có mặt gen chuyển CoOMT dòng thuốc chuyển gen hệ T0 (T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20) Cấu trúc vector pBI121-1113 - CoOMT mang gen chuyển hoạt động tốt mức độ phiên mã ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu biểu gen chuyển CoOMT mức độ dịch mã kỹ thuật Western blot, ELISA, định lượng alkaloid tổng số để đánh giá chức gen thuốc biến đổi gen hệ sau Nghiên cứu biến nạp cấu trúc biểu mang gen CoOMT vào Bình vơi (cây đích), phân tích biểu gen chuyển nhằm đánh giá chức gen sinh tổng hợp alkaloid loại L-tetrahydropalmatin (rotundin) 38 TÀI LI U THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Minh Chính (2001), Nghiên cứu chiết tách Rotundin từ củ số lồi Bình vơi (thuộc chi Stephania Lour.), điều chế Rotundin Sulfat để bào chế thuốc tiêm, Luận án Tiến sĩ dược học, Hà Nội, tr 20-24 Ngô Quang Đại (1999), “Sản xuất thuốc giảm đau từ củ Bình vơi”, Tạp chí cơng nghiệp hóa chất, số 12 Bùi Thị Hà (2018), Nghiên cứu tăng cường biểu gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don), Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học sư phạm, Đại Học Thái Nguyên, tr 4-5, 20-31 Trương Thu Hằng (2013), “Chọn tạo dịng ngơ chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số 3: tr 17-29 Phạm Thu Hằng, Đàm Quang Hiếu, Phan Tuấn Nghĩa, Phạm Xuân Hội (2016), “Thiết kế vector chuyển gen OsNAC1 liên quan đén tính chịu hạn vào giống lúa J02 (Oryzasativa L japonica)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(2): tr 271-277 Võ Thị Thúy Huệ, Mã Yến Thanh (2011), “Thiết lập quy trình tái sinh in vitro đánh giá bước đầu chuyển nạp gen vào dầu mè (Jatropha curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí KHKT Nơng âm Nghiệp, số 1, tr - 10 Đỗ Thanh Kim Hường (2019), Tách dòng thiết kế vector biểu gen GmDREB7 phân lập từ đậu tương, Trung tâm học liệu công nghệ thông tin, Đại Học Thái Nguyên, tr 37-40 Nguyễn Thị Ngọc Lan, Từ Quang Tân, Chu Hoàng Mậu (2020), Sinh học đại, số vấn đề nguyên lý ưng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội (2020), tr.32-32, 90-118, 261 39 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, phần III Các vị thuốc có chất độc, Nxb Y Học, Hà Nội, tr 185-205 10 Phạm Duy Mai, Phan Đức Thuận (1986), Tác dụng Dược lý Bình vơi, Cơng trình NCKH Viện Dược liệu 1972 -1986, NXB Y học, Hà nội, 55-57 11 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Hữu Quân, Lê Thị Hồng Trang (2019), “Chuyển gen Glycine max Chalcone Iomerase1A vào thuốc thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Một mơ hình cho tăng cường biểu gen GmCHI1A đạu tương”, TNU Journal of Science and Technology 207(14), tr 195-200 12 Chu Hoàng Mậu (2005) Phương pháp sinh học phân tử, NXB Đại học Sư phạm, tr.98, 109-114, 115-117 13 Chu Hoàng Mậu, Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Hữu Quân (2019), Giáo trình tin sinh học (Bioinformatics), NXB Đại học Thái Nguyên, tr.95-100 14 Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2012), “Nghiên Cứu Quy Trình Chuyển Gen Vào Cây Dưa Hấu (Citrullus lanatus Thumb.)”, Tạp chí sinh học, 34(3): tr 389-396 15 Lê Thu Ngọc, Nguyễn Khắc Hưng, Nguyễn Thị Thơm, Phạm Bích Ngọc (2017), “Nghiên cứu tạo thuốc chuyển gen ssiv tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, tr 224-230 16 Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh Chu Hồng Mậu (2013), “Tách dịng, thiết kế vector chuyển gene GmEXP1 vào thuốc (Nicotinana tabacum L.)”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số 4, tr 44-52 17 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005) Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội, tra 97-115 18 Vì Thị Xn Thủy, Bùi Thị Minh Thúy, Hoàng Thị Huệ Khang, Chu Hoàng Mậu (2017), “Chuyển gen ZmDEF1 nhờ Agrobacterium tumefaciens 40 vào giống thuốc (Nicotiana tabacum L.) C9-1”, Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, tr 39-41 19 Nguyễn Văn Vân, Hồng Minh Tấn (2013), “Kìm hãm hoa giống thuốc k326 chiếu sáng bổ sung, quang gián đoạn cắt thân“, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 11, số 5: tr 629-634 20 Nguyễn Văn Vinh (2010), “Khảo sát số hợp chất alkaloid có hoạt tính sinh học dưa cạn (Catharanthus roceus L.) điều kiện nuôi in vitro”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, Tập 48, số 1, tr 87-95 TÀI LI U TIẾNG ANH 21 Chen P.Y., Wang C.K., Soong S.C., To K.Y (2003), “Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants”, Mol Breed., 11, 287-293 22 Demura T., Ye Z.H (2010), „„Regulation of Plant Biomass Production‟‟, Curen Opin Plant Biology, pp 299-304 23 Edwards K.D (2017), “A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency”, https://www ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5474855/, ngày 19/06/2017 24 Hongyuan Chu , Guozhang Jin, Eitan Friedman Xuechu Zhen (2008), “Recent Development in Studies of Tetrahydroprotoberberines: Mechanism in Antinociception and Drug Addiction” Cell Mol Neurobiol, 28, 491–499 25 Hotta T., Tanimura H (1997), “Modulation of multidrug resistance by cepharanthin in fresh human gastrointestinal tumor cells”, Oncology, 54, pp 153-157 26 Lo Thi Mai Thu, Vi Thi Xuan Thuy, Le Hoang Duc, Le Van Son, Chu Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2016), “RNAi-mediated resistance to SMV and BYMV in transgenic tobacco”, Crop Breeding and Applied Biotechnology, 6, pp 213 - 218 41 27 Manske R.H.F (1973), The alkaloid- chemistry and Physiology, volume XIV, Academic Press- New York- London 28 Mantsch J.R., Li S.J., Risinger R., Awad S., Katz E., Baker D.A., Yang Z (2007), “Levo-tetrahydropalmatine attenuates cocaine selfadministration and cocaine-induced reinstatement in rats”, Psychopharmacology (Berl), 192, pp 581-591 29 Ramachandra Rao S., Ravishakar G A (2002), “Plannt cell culture: chemical factory of secondary metabolite”, Biotechnology Advance, 20, 101-153 30 Saghhai Maroof M.A.,Solima K.M., Jorgenson R.A , Allard R.W (1984), “Ribosome DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, choromosomal location and population dynamics”, Natl Aca Sci.USA, 81: 8014 – 8018 31 Sandra Knapp, Details for species Nicotiana tabacum, https://solgenomics net/organism/941/view 32 Sandro Jube (2007), Expression of bacterial genes in transgenic tobacco: methods, applications and future prospects, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pmc/articles/PMC2742426/, ngày 15/07/2007 33 Thanh Son LO., Hoang Duc LE., Vu Thanh Thanh NGUYEN., Hoang Ha CHU., Van Son LE., Hoang Mau CHU (2015), “Overexpression of a soybean expansin gen, GmEXP1, improves drought tolerance in transgenic tobacco”, Turkish Journal of Botany, 39, pp 988 - 995 34 Takashi Morishige, Emilyn Dubouzet, Kum-Boo Choi, Kazufumi Yazaki, Fumihiko Sato (2002), “Molecular cloning of columbamine O- methyltransferase from cultured Coptis japonica cells”, Eur J Biochem., 269(22): pp 5659-67 35 Topping J.E (1998), "Tobacco transformation", Methods Mol Biol., 81, pp 365-372 42 36 Tzfira T., Citovsky V (2006), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology”, Curr Opin Biotechnol, 17:147–154 37 Xuan Tan DAO, Thi Thanh Nhan PHAM, Thi Kim Lien VU, Huu Quan NGUYEN, Thi Ngoc Lan NGUYEN, Danh Thuong SY, Thi Thu Thuy VU, Van Son LE, Hoang Mau CHU (2019), “Overexpression of the GmDREB2 gene increases proline accumulation and tolerance to drought stress in soybean plants”, Australian Journal of Crop Science, Ref No: AJCSPNE2173, ISSN 1835-2707 (Online), ISSN: 1835-2693 (Print) INTERNET 38 Kỹ thuật PCR (2016) https://biomedia.vn/review/ky-thuat-pcr-phan-1.html, 19/01/2016 39 Kỹ thuật điện di ngang gel agarose (2019) https://genesmart.vn/kythuat-dien-di-ngang-tren-gel-agarose 40 Giới thiệu chung thuốc (2014) http://www.thuvientailieu.vn/tailieu/de-tai-gioi-thieu-chung-ve-cay-thuoc-la-27708, 17/04/2014 41 Sản xuất thuốc giảm đau từ củ bình vơi (1999), 30/12/1999 http://www.vinachem.com.vn/xuat-ban-pham/239-so-vnc/c3239.html 42 Thuốc Rotunda 30mg (2021) https://baomuctim.com/rotunda-30mg, 27/04/2021 43 Vi khuẩn Agrobacterium (2021) https://en.wikipedia.org/wiki/ Agrobacterium, 11/4/2021 44 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (2021) https://en.wikipedia.org/wiki/ Agrobacterium_tumefaciens, 24/4/2021 45 Gene chuyển Ti-plasmid (2021) https://en.wikipedia.org/wiki /Ti_plasmid , 142021 46 Ứng dụng nguyên lý kỹ thuật Southern blot (2018) https://khonggiansinhhoc.com/ung-dung-va-nguyen-ly-cua-ky-thuatsouthern-blot, 21/7/2018 43 47 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15596026#/15596026) 48 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K1621#/K1621 49 Vector chuyển gen thực vật (2018) https://khonggiansinhhoc.com/cacvector-chuyen-gen-o-thuc-vat/, 4/7/2018 50 Hợp chất Rotundin https://www.irdop.org/post/hiện tượng đa hình rotundin 51 Hợp chất tách từ bình vơi ; https://hoibacsy.vn/binh-voi-stephania-sppho-tiet-de-menispermaceae/ 52 Ezyme Columbamine O-methyltransferase ; https://en.wikipedia.org/ wiki/ Columbamine_O-methyltransferase 23/9/2019 53 https://www.wikiwand.com/vi/Phản_ứng_tổng_hợp_chuỗi_polymerase_sao _chép_ngược 44 ... (NICOTIANA TABACUM L.)? ?? Mục tiêu nghiên cứu T? ?o số dòng thuốc (Nicotiana Tabacum L.) mang gen chuyển CoOMT hệ T0 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme CoOMT v? ?o thuốc Phân tích... gen CoOMT trình nâng cao suất tổng hợp chất ankaloid loại rotundin, tiến hành thực đề tài: “NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE (CoOMT) V? ?O CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA. .. XAYKHAM THIPPHAVONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE (CoOMT) V? ?O CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) Ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 8420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH