4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
2.3.1. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá
Biến nạp cấu trúc mang gen chuyển CoOMT thông qua lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens vào mảnh lá và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen được thực hiện như mô tả củaTopping (1998) [35].
Tạo nguyên liệu biến nạp gen:
Để có nguyên liệu phục vụ biến nạp cấu trúc vector mang gen chuyển
CoOMT vào cây mô hình, chúng tôi sử dụng một bình mẫu cây thuốc lá in vitro
tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên để nhân giống. Phần thân cây được cắt thành các đoạn ngắn có kích thước khoảng 0,5 - 1 cm và được cấy trên môi trường MS0 + sucrose 30 g/l+ agar 12 g/l. Các mẫu lá non được cắt thành các mảnh lá có kích thước khoảng 1 cm2 và được cấy trên môi trường MS0 + sucrose 30 g/l+ agar 12 g/l có bổ sung BAP 1,5 mg/l [8].
Các môi trường đều được chuẩn pH= 5,8 và khử trùng. Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25°C ± 2, với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, cường độ chiếu sáng 2 000 lux. Khi mẫu đoạn thân hoặc mảnh lá tạo được chồi mới, chồi được chuyển sang môi trường MS0 + sucrose 30 g/l + agar 12 g/l + IBA 0,2 mg/l. Khi mẫu phát triển thành cây hoàn chỉnh sau 5 - 7 tuần tuổi với 6 - 7 lá được thu làm vật liệu để biến nạp gen [11], [15].
Tạo dịch huyền phù A. tumefaciens:
A.tumefaciens chủng AGL1 chứa plasmid pBI121-1113 được cất giữ trong glycerol ở -20°C. Bước chuẩn bị vi khuẩn là nuôi khuẩn trong môi trường LB lỏng 20 ml có bổ sung kháng sinh rifamycine 20 l, karnamycine 20 l, carbecillin 20 l nuôi ở nhiệt độ 28°C lắc ở 150 vòng/phút trong 3-5 ngày. Tiếp theo là nuôi vi khuẩn hoạt hóa (nuôi buổi sáng) trong môi trường LB lỏng 50 ml có bổ sung kháng sinh rifamycine 100 l, karnamycine 50 l, carbecillin 50 l và lắc ở 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 °C, tiến hành nuôi 6 tiếng. Sau 6 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy (40 ml) trên ly tâm với tốc độ 5.000
OD cho tới khi đạt được OD600 ≈ 0.5- 1.0 và lấy một phần nữa (5 ml) làm đối chứng khi đo OD. Loại bỏ dịch nổi và thu cặn vi khuẩn. Hòa tan tế bào vi khuẩn lắng để tạo huyền phù vi khuẩn bằng cách đổ dung dịch ½ MS (nồng độ ½ MS tùy theo giá trị OD) và AS100 vào ống falcon và lắc nhẹ. Dịch huyền phù vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm ngay với mảnh lá thuốc lá [15].
Biến nạp hoặc lây nhiễm vi khuẩn với lá:
Vật liệu nhận gen là các mảnh lá thuốc lá có kích thước khoảng 1 cm2 được gây tổn thương quanh mép lá. Sau đó ngâm mảnh lá trong dịch huyền phù vi khuẩn, lắc nhẹ trong tủ cấy điều kiện vô trùng trong thời gian 25-30 phút. Trong dịch khuẩn gồm cặn vi khuẩn, 100 ml môi trường ½ MS có bổ sung AS100. Sau 30 phút những mảnh lá nhiễm khuẩn được thấm khô trong thời gian nhất định.
Đồng nuôi cấy:
Mảnh lá khô sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP 1,5 mg/l, AS100 trên đĩa petri, nuôi trong tối, ở nhiệt độ 21°C trong 2 ngày 2 đêm (48 tiếng).
Nuôi phục hồi và tạo chồi:
Sau khi nuôi trong tối 48 tiếng mẫu được rửa bằng nước cất khử trùng có kháng sinh cefotaxime nồng độ 50 mg/l trong 30 phút và làm thật khô. Sau đó chuyển mẫu sang môi trường MS0 + 1,5 mg/l BAP có bổ sung chất kháng sinh thực vật kanamycine 50 mg/l và cefotaxime 50 mg/l, nuôi trong sáng, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, ở nhiệt độ 25 ± 20°C trong 6 tuần. Trong thời gian nuôi phục hồi mẫu được chuyển sang môi trường mới trong mỗi 14 ngày.
Tái sinh cây biến nạp gen hoàn chỉnh:
Các chồi non từ môi trường tạo chồi được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh MS0 có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật, nuôi sáng ở 25°C, thời gian 20- 30 ngày. Sau đó các cây thuốc lá non được chuyển sang môi trường tạo rễ MS0 + IBA với nồng độ 0,2 mg/l và có bổ sung chất kháng
sinh thực vật kanamycine 50 mg/l và cefotaxime 50 mg/l trong 20 ngày. Khi cây trưởng thành có thể sử dụng để chuẩn bị phân tích và chuẩn bị mang ra vườn ươm [6], [16].
Chuyển cây ra đất:
Cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc MS0 + IBA có 2-5 lá và có 3-4 rễ được chuyển trồng trên giá thể trong vườn ươm để tiến hành đánh giá cây chuyển gen [4], [8].