4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
3.2.2. Kết quả phân tích biểu hiện gene CoOMT bằng phản ứng semi-
quantitative PCR (semi- qPCR)
Để đánh giá hiệu quả hoạt động của cấu trúc vector mang gen chuyển
CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen làm cơ sở để chuyển cấu trúc vào cây Bình vôi, nhằm nâng cao hàm lượng dược chất có hoạt tính rotundin, RNA tổng số của cây WT và 06 dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 (T0-6, T0-7, T0- 8, T0-9, T0-10, T0-20) tiếp tục được sử dụng để phân tích mức độ biểu hiện của gen chuyển CoOMT ở mức phiên mã bằng phản ứng semi-qPCR.
Kết quả phản ứng semi-qPCR vừa là cơ sở để đánh giá định tính mức độ phiên mã, vừa khảo sát tính đặc hiệu của hai cặp mồi ActNF/ ActNR của gen
Actin và COMT-qF/ COMT-qR của gen CoOMT khi thực hiện phản ứng qRT- PCR định lượng chính xác mức độ phiên mã của gen. Kết quả semi-qPCR được thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm semi-qPCR phân tích sự biểu hiện của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng
(WT: sản phẩm nhân gen CoOMT từ cây Wild type- cây thuốc lá không chuyển gen; 6, 7, 8, 9,10, 20: sản phẩm nhân gen CoOMT từ các dòng
Từ kết quả thể hiện ở hình 3.5, các band sản phẩm phản ứng semi-qPCR của gen tham chiếu Actin ở 01 mẫu cây WT và 06 mẫu cây chuyển gen thế hệ T0 (T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20) tương đối đều nhau. Điều này cho thấy mức độ phiên mã của gen Actin ở các cây đều như nhau ở mọi điều kiện, đúng với lý thuyết về gen tham chiếu (house-keeping gene). Trong khi đó, gen chuyển CoOMT chỉ biểu hiện ở cây chuyển gen, không biểu hiện ở cây WT. Ở 26 chu kì, sự phiên mã của gen chuyển CoOMT ở 6 cây chuyển gen thấp hơn. Khi lên 28 chu kì, sự phiên mã của gen chuyển CoOMT ở 6 cây chuyển gen mạnh hơn cả gen tham chiếu Actin ở 30 chu kì. Các band sản phẩm phản ứng semi-qPCR của gen CoOMT đều có kích thước to và rõ nét hơn các band sản phẩm phản ứng semi-qPCR của gen tham chiếu Actin ở 6 mẫu cây chuyển gen thế hệ T0. Kết quả này bước đầu chứng tỏ cấu trúc vector chuyển gen mang gen chuyển CoOMT đã hoạt động tốt ở mức độ phiên mã. Gen đích đã được biểu hiện mạnh nhờ promoter có trong vector.
Từ kết quả này, chúng tôi lựa chọn RNA tổng số của mẫu cây WT, mẫu T0-07, T0-09, T0-20 làm đại diện cho các mức độ phiên mã khác nhau (đối chứng- WT, biểu hiện thấp, biểu hiện cao) để định lượng chính xác mức độ phiên mã bằng phản ứng qRT-PCR với cặp mồi ActNF/ ActNR của gen Actin
và COMT-qF/ COMT-qR của gen CoOMT đã được thiết kế và kiểm tra bằng phản ứng semi-qPCR. Kết quả qRT-PCR là một minh chứng khẳng định cấu trúc chuyển gen pBI121-1113 – CoOMT hoạt động tốt trên cây mô hình, có thể chuyển vào cây đích để phân tích chức năng gen trong việc cải thiện hàm lượng dược chất rotundin và alkaloid.