4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
2.3.2. Phương pháp phân tích cây chuyển gen
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
RNA được tách từ lá cây thuốc lá chuyển gene bằng Trizol™ Reagent [47],[47]. Các bước thực hiện:
(1) Nghiền mịn mẫu lá thuốc lá trong nitơ lỏng, lấy 300 mg bột mẫu vào eppendorf 2 ml đã khử DEPC.
(2) Bổ sung 1ml Trizol, trộn đều mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút.
(3) Bổ sung 1ml hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (24 : 1), lắc mạnh trong 15 giây, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.
(4) Li tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút, hút 600 l dịch phía trên chuyển sang eppendorf 1,5 ml đã khử DEPC.
(5) Bổ sung 500 l isopropanol, lắc nhẹ, đặt mẫu trong tủ -20 o
C trong 30 phút để tủa RNA. Li tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn.
(6) Bổ sung 500 l cồn 70 o để rửa. Li tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn (bước này thực hiện 2 lần).
(7) Làm khô mẫu trong box bật quạt 5 phút, hòa tan cặn bằng 50 l nước khử ion có DEPC và DNase, bảo quản mẫu ở -86 o
C.
2.3.2.2. Phương pháp RT- PCR xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen
- Thiết kế và tổng hợp mồi: Dựa trên trình tự gen đăng kí trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI mã số AB073908 và cấu trúc vector pBI121-1113 mang gen
peptid tín hiệu cmyc và trình tự cắt của enzyme giới hạn ở hai đầu, tổng kích thước là 113 bp. Chúng tôi sử dụng phần mềm DNAstar thiết kế cặp mồi đặc trưng cho phản ứng RT- PCR, semi-qPCR, qRT- PCR phân tích cây thuốc lá chuyển gen. Thông tin về các cặp mồi được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.2. Cặp mồi đặc trƣng của phản ứng RT-PCR TT Tên mồi Trình tự (5' - 3') Nhiệt độ bắt cặp Kích thƣớc gen dự kiến 1 RT-Fw TCTAGAATGGATACTCCGAACAC 58oC 1113bp 2 RT-Rv GAGCTCTCAGAGTTCGTCTT
- 1.5 g RNA được sử dụng để tổng hợp cDNA theo hướng dẫn của bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit [47]. Phản ứng RT- PCR được thực hiện qua hai giai đoạn.
(1) Giai đoạn RT: Đây là giai đoạn tổng hợp cDNA từ mRNA. Phản ứng được thực hiện theo hướng dẫn của hãng sản xuất Fermentas.
Bước 1: Trộn hỗn hợp gồm 3 l RNA, 1 l mồi Oligo(dT)18, 8 l nước khử ion khử DEPC, li tâm nhanh mẫu, ủ ở 65o
C trong 5 phút.
Bước 2: Bổ sung 2 l dung dịch đệm cho enzyme phiên mã ngược, 1 l dNTPs, 1µl Inhibitor, li tâm nhanh mẫu, đặt mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Bước 3: Bổ sung 1 l reverse transcriptase. Sau đó đặt mẫu vào máy PCR với chu trình nhiệt 42 oC trong 1 giờ và 70 o
C trong 10 phút.
(2) Giai đoạn PCR: cDNA được sử dụng làm khuôn để khuếch đại gen
CoOMT. Thành phần của phản ứng được trình bày trong Bảng 2.2.
Chu trình nhiệt cho phản ứng RT- PCR gen CoOMT là 94˚C: 3 phút 30 giây; (94 ˚C: 30 giây; 58 ˚C: 50 giây; 72 ˚C: 1 phút 20 giây) lặp lại 30 chu kỳ; 72 ˚C: 10 phút; 4 ˚C: ∞.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) Nước deion - 7,5 Master mix 2 X 12,5 Primer ( F+ R) 10 pmol/ l 2,0 cDNA/DNA 100 ng/ l 2
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 %. Sau đó, nhuộm gel trong dung dịch EtBr, soi gel và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Mỗi mẫu biến nạp là mảnh lá được tái sinh chồi từ mảnh lá đó và 3 lần chọn lọc bằng kháng sinh. Các chồi sống sót sau chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa trồng trên giá thể. Số cây hoàn chính của mỗi mẫu biến nạp gen dương tính với PCR được tạo thành một dòng cây thuốc lá chuyển gen. Hiệu suất chuyển gen được tính theo công thức:
Hiệu suất chuyển gen (%) =
Số dòng cây chuyển gen sống sót trên môi trường chọn lọc/dương tính với PCR
Tổng số mẫu biến nạp
2.3.2.3. Phương pháp phân tích sự biểu hiện gen CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen bằng phản ứng PCR bán định lượng (semi - qPCR)
Các cặp mồi của gen tham chiếu Actin và gen đích CoOMT được thiết kế dựa trên trình tự gen trên Genbank và tổng hợp theo đơn đặt hàng với Công ty Phù Sa (Việt Nam) để sử dụng cho phản ứng PCR bán định lượng (semi - qPCR) và realtime RT-PCR (qRT - PCR) nhằm phân tích mức độ phiên mã và hoạt động của cấu trúc vector chuyển gen trong cây mô hình (thuốc lá). Thành
Bảng 2.4. Thông tin trình tự mồi trong phản ứng semi- qPCR và qRT-PCR
Tên mồi Trình tự mồi 5’- 3’ Nhiệt độ bắt cặp
ActNF GATCTTGCTGGTCGTGATCTT 58oC ActNR GTCTCCAACTCTTGCTCATAGTC COMT-qF CGCTCCACAATTACGAGGAT 60oC COMT-qR CAGTGGTAAATTCTCGGTGTCC
Chu trình nhiệt cho phản ứng semi-qPCR đoạn gen tham chiếu (house- keeping gene) Actin là 94 ˚C: 5 phút; (94 ˚C: 20 giây; 58 ˚C: 20 giây; 72 ˚C: 30 giây) lặp lại 26, 28, 30 chu kỳ; 72 ˚C: 10 phút; 4 ˚C: ∞.
Chu trình nhiệt cho phản ứng semi-qPCR đoạn gen CoOMT là 94˚C: 5 phút; (94 ˚C: 20 giây; 60 ˚C: 20 giây; 72 ˚C: 30 giây) lặp lại 26, 28, 30 chu kỳ; 72 ˚C: 10 phút; 4 ˚C: ∞.
Sản phẩm semi-qPCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau đó, nhuộm gel trong dung dịch EtBr, soi gel và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN