4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
3.1.3. Kết quả biến nạp gen CoOMT vào cây thuốc lá
Các mảnh lá thuốc lá có kích thước khoảng 1 cm2 đã được gây tổn thương quanh mép lá. Sau đó ngâm mảnh lá trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 25 - 30 phút (Hình 3.1 A).
Đồng nuôi cấy: Mảnh lá khô sau lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP 1,5 mg/l, AS100 trên đĩa petri,
Sau khi nuôi trong tối 48 tiếng, mẫu được rửa bằng nước cất khử trùng có kháng sinh cefotaxime 50 mg/l, sau rửa xong mẫu được làm khô và chuyển mẫu lên môi trường tạo chồi (SIM) MS0 có bổ sung BAP 1,5 mg/l, kanamycine 50 mg/l và cefotaxime 50 mg/l (Hình 3.1 C, D).
Chồi tái sinh được chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM) MS0 + BAP 1,5 mg/l BAP có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật và kháng sinh chọn lọc vector tái tổ hợp, nuôi trong thời gian 20 - 30 ngày (Hình 3.1 E).
Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 1 - 2 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ (RM) MS0 + IBA 0.2 mg/l bổ sung kháng sinh chọn lọc trong 14 ngày (Hình 3.1 F, G).
Cây tái sinh trên môi trường chọn lọc có 2 - 5 lá, có 3 - 4 rễ đã trở thành cây hoàn chỉnh (Hình 3.1 H) được chuyển ra đất trồng và để tiến hành đánh giá hiệu suất chuyển gen và phân tích cây chuyển gen (hình 3.2).
A: Mảnh lá cây thuốc lá được ngâm trong dịch khuẩn AGL1 ; B: Mảnh lá cây thuốc lá trên môi trường đồng nuôi cấy ; C: Các mảnh lá cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM trong 2 tuần ; D: Chồi sinh trương trên môi trường SIM ; E : Các chồi đang tái sinh trên môi trường SEM trong 2 tuần ; F, G : Cây tạo ra rễ trên môi trường RM ; H: cây hoàn chỉnh.
Kết quả chuyển cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT vào giống thuốc lá mô hình giống K326 trong 3 lần biến nạp với 150 mẫu và 60 mẫu đối chứng. Đối với mẫu biến nạp 150 mẫu qua 5 bước từ biến nạp gen, đồng nuôi cấy, tạo chồi, tái sinh chồi, tạo cây hoàn chỉnh và đưa cây trồng trên giá thể được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp vector mang gen CoOMT vào cây thuốc lá Đối chứng và thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo cụm chồi Số chồi tái sinh Số cây ra rễ Số cây trồng trên giá thể ĐC1 30 19 52 31 17 ĐC0 30 0 0 0 0 Thí nghiệm 1 50 14 25 14 9 2 50 33 72 40 17 3 50 22 55 30 15 Tổng 150 69 152 84 41
Ghi chú: ĐC1 là lá mầm cây thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh; ĐC0 là lá cây thuốc lá không
chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh
Trên bảng trên cho thấy với 150 mẫu cây, sau ba lần biến nạp thu được 69 mẫu tạo cụm chồi và có 152 mẫu chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc MS chứa cefotaxime, kanamycin và trong đó có 84 mẫu ra rễ, còn 41 cây trên giá thế. Trong khi đó ĐC0 là 30 mẫu không chuyển gen được nuôi trên môi trường chọn lọc kháng sinh thì không xuất hiện mẫu tạo chồi, ở ĐC1 thì có 19 mẫu ra
Hiệu suất chuyển gen giai đoạn này là 27,3 %. Kết quả này phù hợp với các công trình đã công bố trước đây [3], [26], [33], [37].
Về nguyên lý khoa học, cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT (pBI121-1113 - CoOMT) được thiết kế mang thêm gen chỉ thị kháng sinh. Do vậy, những mẫu nhận được cấu trúc này đều có khả năng sống sót, sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycine. Những mẫu không nhận được cấu trúc chuyển gen và cây đối chứng đều không có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycine hoặc tạo những kiểu hình kém phát triển (màu lá ngày càng ngà vàng, kích thước mẫu nhỏ, xoăn và dị dạng ...), nếu nuôi cấy trong thời gian dài mẫu sẽ chết.
Hình 3.2. Một cây thuốc lá chuyển gen trong nhà lƣới