4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro và chuyển gen ở cây thuốc lá thông qua
A. tumefaciens được tiến hành trên trang thiết bị của Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ gen của khoa sinh học trường Đai học sư phạm Thái Nguyên. Thí nghiệm ra cây được bố trí tại vườn ươm của trường.
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh thuốc lá
Môi trƣờng Ký
hiệu Thành phần
Nuôi cây in vitro (chuẩn bị vật liệu)
MS cơ bản + sucrose 30g/l + agar 12 g/l Đồng nuôi cấy (Co-
cultivation medium) CCM
MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 14 g/l + AS100 + BAP 1,5 mg/l; pH = 5,4 Cảm ứng tạo đa chồi
(Shoot induction medium) SIM
MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 14 g/l + BAP 1,5 mg/l+ kanamycine 50 mg/l + cefotacime 50 mg/l.
Kéo dài chồi (Shoot
elongation medium) SEM
MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 14 g/l + IAA 0,1 mg/l+kanamycine 50 mg/l +cefotacime 50 mg/l.
Ra rễ (Rooting medium) RM
MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 14 g/l + IBA 0,2 mg/l + kanamycine 50 mg/l
Thời gian nghiên cứu: Từ 8/2020 đến 6/2021.
Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen được mô tả tổng quát trong hình 2.2.
2.3.1. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá
Biến nạp cấu trúc mang gen chuyển CoOMT thông qua lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens vào mảnh lá và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen được thực hiện như mô tả củaTopping (1998) [35].
Tạo nguyên liệu biến nạp gen:
Để có nguyên liệu phục vụ biến nạp cấu trúc vector mang gen chuyển
CoOMT vào cây mô hình, chúng tôi sử dụng một bình mẫu cây thuốc lá in vitro
tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên để nhân giống. Phần thân cây được cắt thành các đoạn ngắn có kích thước khoảng 0,5 - 1 cm và được cấy trên môi trường MS0 + sucrose 30 g/l+ agar 12 g/l. Các mẫu lá non được cắt thành các mảnh lá có kích thước khoảng 1 cm2 và được cấy trên môi trường MS0 + sucrose 30 g/l+ agar 12 g/l có bổ sung BAP 1,5 mg/l [8].
Các môi trường đều được chuẩn pH= 5,8 và khử trùng. Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25°C ± 2, với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, cường độ chiếu sáng 2 000 lux. Khi mẫu đoạn thân hoặc mảnh lá tạo được chồi mới, chồi được chuyển sang môi trường MS0 + sucrose 30 g/l + agar 12 g/l + IBA 0,2 mg/l. Khi mẫu phát triển thành cây hoàn chỉnh sau 5 - 7 tuần tuổi với 6 - 7 lá được thu làm vật liệu để biến nạp gen [11], [15].
Tạo dịch huyền phù A. tumefaciens:
A.tumefaciens chủng AGL1 chứa plasmid pBI121-1113 được cất giữ trong glycerol ở -20°C. Bước chuẩn bị vi khuẩn là nuôi khuẩn trong môi trường LB lỏng 20 ml có bổ sung kháng sinh rifamycine 20 l, karnamycine 20 l, carbecillin 20 l nuôi ở nhiệt độ 28°C lắc ở 150 vòng/phút trong 3-5 ngày. Tiếp theo là nuôi vi khuẩn hoạt hóa (nuôi buổi sáng) trong môi trường LB lỏng 50 ml có bổ sung kháng sinh rifamycine 100 l, karnamycine 50 l, carbecillin 50 l và lắc ở 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 °C, tiến hành nuôi 6 tiếng. Sau 6 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy (40 ml) trên ly tâm với tốc độ 5.000
OD cho tới khi đạt được OD600 ≈ 0.5- 1.0 và lấy một phần nữa (5 ml) làm đối chứng khi đo OD. Loại bỏ dịch nổi và thu cặn vi khuẩn. Hòa tan tế bào vi khuẩn lắng để tạo huyền phù vi khuẩn bằng cách đổ dung dịch ½ MS (nồng độ ½ MS tùy theo giá trị OD) và AS100 vào ống falcon và lắc nhẹ. Dịch huyền phù vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm ngay với mảnh lá thuốc lá [15].
Biến nạp hoặc lây nhiễm vi khuẩn với lá:
Vật liệu nhận gen là các mảnh lá thuốc lá có kích thước khoảng 1 cm2 được gây tổn thương quanh mép lá. Sau đó ngâm mảnh lá trong dịch huyền phù vi khuẩn, lắc nhẹ trong tủ cấy điều kiện vô trùng trong thời gian 25-30 phút. Trong dịch khuẩn gồm cặn vi khuẩn, 100 ml môi trường ½ MS có bổ sung AS100. Sau 30 phút những mảnh lá nhiễm khuẩn được thấm khô trong thời gian nhất định.
Đồng nuôi cấy:
Mảnh lá khô sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP 1,5 mg/l, AS100 trên đĩa petri, nuôi trong tối, ở nhiệt độ 21°C trong 2 ngày 2 đêm (48 tiếng).
Nuôi phục hồi và tạo chồi:
Sau khi nuôi trong tối 48 tiếng mẫu được rửa bằng nước cất khử trùng có kháng sinh cefotaxime nồng độ 50 mg/l trong 30 phút và làm thật khô. Sau đó chuyển mẫu sang môi trường MS0 + 1,5 mg/l BAP có bổ sung chất kháng sinh thực vật kanamycine 50 mg/l và cefotaxime 50 mg/l, nuôi trong sáng, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, ở nhiệt độ 25 ± 20°C trong 6 tuần. Trong thời gian nuôi phục hồi mẫu được chuyển sang môi trường mới trong mỗi 14 ngày.
Tái sinh cây biến nạp gen hoàn chỉnh:
Các chồi non từ môi trường tạo chồi được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh MS0 có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật, nuôi sáng ở 25°C, thời gian 20- 30 ngày. Sau đó các cây thuốc lá non được chuyển sang môi trường tạo rễ MS0 + IBA với nồng độ 0,2 mg/l và có bổ sung chất kháng
sinh thực vật kanamycine 50 mg/l và cefotaxime 50 mg/l trong 20 ngày. Khi cây trưởng thành có thể sử dụng để chuẩn bị phân tích và chuẩn bị mang ra vườn ươm [6], [16].
Chuyển cây ra đất:
Cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc MS0 + IBA có 2-5 lá và có 3-4 rễ được chuyển trồng trên giá thể trong vườn ươm để tiến hành đánh giá cây chuyển gen [4], [8].
2.3.2. Phương pháp phân tích cây chuyển gen
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
RNA được tách từ lá cây thuốc lá chuyển gene bằng Trizol™ Reagent [47],[47]. Các bước thực hiện:
(1) Nghiền mịn mẫu lá thuốc lá trong nitơ lỏng, lấy 300 mg bột mẫu vào eppendorf 2 ml đã khử DEPC.
(2) Bổ sung 1ml Trizol, trộn đều mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút.
(3) Bổ sung 1ml hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (24 : 1), lắc mạnh trong 15 giây, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.
(4) Li tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút, hút 600 l dịch phía trên chuyển sang eppendorf 1,5 ml đã khử DEPC.
(5) Bổ sung 500 l isopropanol, lắc nhẹ, đặt mẫu trong tủ -20 o
C trong 30 phút để tủa RNA. Li tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn.
(6) Bổ sung 500 l cồn 70 o để rửa. Li tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn (bước này thực hiện 2 lần).
(7) Làm khô mẫu trong box bật quạt 5 phút, hòa tan cặn bằng 50 l nước khử ion có DEPC và DNase, bảo quản mẫu ở -86 o
C.
2.3.2.2. Phương pháp RT- PCR xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen
- Thiết kế và tổng hợp mồi: Dựa trên trình tự gen đăng kí trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI mã số AB073908 và cấu trúc vector pBI121-1113 mang gen
peptid tín hiệu cmyc và trình tự cắt của enzyme giới hạn ở hai đầu, tổng kích thước là 113 bp. Chúng tôi sử dụng phần mềm DNAstar thiết kế cặp mồi đặc trưng cho phản ứng RT- PCR, semi-qPCR, qRT- PCR phân tích cây thuốc lá chuyển gen. Thông tin về các cặp mồi được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.2. Cặp mồi đặc trƣng của phản ứng RT-PCR TT Tên mồi Trình tự (5' - 3') Nhiệt độ bắt cặp Kích thƣớc gen dự kiến 1 RT-Fw TCTAGAATGGATACTCCGAACAC 58oC 1113bp 2 RT-Rv GAGCTCTCAGAGTTCGTCTT
- 1.5 g RNA được sử dụng để tổng hợp cDNA theo hướng dẫn của bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit [47]. Phản ứng RT- PCR được thực hiện qua hai giai đoạn.
(1) Giai đoạn RT: Đây là giai đoạn tổng hợp cDNA từ mRNA. Phản ứng được thực hiện theo hướng dẫn của hãng sản xuất Fermentas.
Bước 1: Trộn hỗn hợp gồm 3 l RNA, 1 l mồi Oligo(dT)18, 8 l nước khử ion khử DEPC, li tâm nhanh mẫu, ủ ở 65o
C trong 5 phút.
Bước 2: Bổ sung 2 l dung dịch đệm cho enzyme phiên mã ngược, 1 l dNTPs, 1µl Inhibitor, li tâm nhanh mẫu, đặt mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Bước 3: Bổ sung 1 l reverse transcriptase. Sau đó đặt mẫu vào máy PCR với chu trình nhiệt 42 oC trong 1 giờ và 70 o
C trong 10 phút.
(2) Giai đoạn PCR: cDNA được sử dụng làm khuôn để khuếch đại gen
CoOMT. Thành phần của phản ứng được trình bày trong Bảng 2.2.
Chu trình nhiệt cho phản ứng RT- PCR gen CoOMT là 94˚C: 3 phút 30 giây; (94 ˚C: 30 giây; 58 ˚C: 50 giây; 72 ˚C: 1 phút 20 giây) lặp lại 30 chu kỳ; 72 ˚C: 10 phút; 4 ˚C: ∞.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) Nước deion - 7,5 Master mix 2 X 12,5 Primer ( F+ R) 10 pmol/ l 2,0 cDNA/DNA 100 ng/ l 2
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 %. Sau đó, nhuộm gel trong dung dịch EtBr, soi gel và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Mỗi mẫu biến nạp là mảnh lá được tái sinh chồi từ mảnh lá đó và 3 lần chọn lọc bằng kháng sinh. Các chồi sống sót sau chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa trồng trên giá thể. Số cây hoàn chính của mỗi mẫu biến nạp gen dương tính với PCR được tạo thành một dòng cây thuốc lá chuyển gen. Hiệu suất chuyển gen được tính theo công thức:
Hiệu suất chuyển gen (%) =
Số dòng cây chuyển gen sống sót trên môi trường chọn lọc/dương tính với PCR
Tổng số mẫu biến nạp
2.3.2.3. Phương pháp phân tích sự biểu hiện gen CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen bằng phản ứng PCR bán định lượng (semi - qPCR)
Các cặp mồi của gen tham chiếu Actin và gen đích CoOMT được thiết kế dựa trên trình tự gen trên Genbank và tổng hợp theo đơn đặt hàng với Công ty Phù Sa (Việt Nam) để sử dụng cho phản ứng PCR bán định lượng (semi - qPCR) và realtime RT-PCR (qRT - PCR) nhằm phân tích mức độ phiên mã và hoạt động của cấu trúc vector chuyển gen trong cây mô hình (thuốc lá). Thành
Bảng 2.4. Thông tin trình tự mồi trong phản ứng semi- qPCR và qRT-PCR
Tên mồi Trình tự mồi 5’- 3’ Nhiệt độ bắt cặp
ActNF GATCTTGCTGGTCGTGATCTT 58oC ActNR GTCTCCAACTCTTGCTCATAGTC COMT-qF CGCTCCACAATTACGAGGAT 60oC COMT-qR CAGTGGTAAATTCTCGGTGTCC
Chu trình nhiệt cho phản ứng semi-qPCR đoạn gen tham chiếu (house- keeping gene) Actin là 94 ˚C: 5 phút; (94 ˚C: 20 giây; 58 ˚C: 20 giây; 72 ˚C: 30 giây) lặp lại 26, 28, 30 chu kỳ; 72 ˚C: 10 phút; 4 ˚C: ∞.
Chu trình nhiệt cho phản ứng semi-qPCR đoạn gen CoOMT là 94˚C: 5 phút; (94 ˚C: 20 giây; 60 ˚C: 20 giây; 72 ˚C: 30 giây) lặp lại 26, 28, 30 chu kỳ; 72 ˚C: 10 phút; 4 ˚C: ∞.
Sản phẩm semi-qPCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau đó, nhuộm gel trong dung dịch EtBr, soi gel và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả chuyển gen CoOMT vào cây thuốc lá
3.1.1. Kết quả nuôi cấy in vitro tạo nguyên liệu biến nạp
Chúng tôi sử dụng cây thuốc lá giống K326 để nuôi cấy in vitro. Phần thân cây được cắt thành các đoạn ngắn có kích thước khoảng 0,5 - 1 cm và được cấy chuyển trên môi trường MS0 + sucrose 30 g/l+ agar 12 g/l. Các mẫu lá non được cắt thành các mảnh lá có kích thước khoảng 1 cm2
và được cấy chuyển lên môi trường MS0 + sucrose 30 g/l+ agar 12 g/l có bổ sung BAP 1,5 mg/ml. Sau mẫu đã tạo được chồi mới, chồi được chuyển sang môi trường MS0+ sucrose 30 g/l + agar 12 g/l + IBA 0,2 mg/l. Khi mẫu phát triển thành hoàn chỉnh sau 5 - 7 tuần tuổi với 6 - 7 lá được thu làm vật liệu biến nạp gen.
3.1.2. Kết quả nuôi hoạt hóa vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 chứa vector chuyển gen CoOMT chuyển gen CoOMT
Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB lỏng 20 ml được bổ sung thêm kháng sinh chọn lọc như: rifamycin 50 mg/l, kanamycin 50 mg/l, carbenicillin 50 mg/l, ở 28 °C, lắc ở 150 vòng/phút trong 3 - 5 ngày. Sau đó sử dụng 1 ml dịch khuẩn nuôi hoạt hóa với 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi trong 4 - 6 tiếng. Kết quả đo OD600nm= 0.63 được ly tâm dịch khuẩn với tốc độ 5000 vòng/phút, ở 4°C trong thời gian 12 phút. Hòa tan tế bào vi khuẩn lắng tạo huyền phù trong dung dịch ½ MS và AS100.
3.1.3. Kết quả biến nạp gen CoOMT vào cây thuốc lá
Các mảnh lá thuốc lá có kích thước khoảng 1 cm2 đã được gây tổn thương quanh mép lá. Sau đó ngâm mảnh lá trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 25 - 30 phút (Hình 3.1 A).
Đồng nuôi cấy: Mảnh lá khô sau lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP 1,5 mg/l, AS100 trên đĩa petri,
Sau khi nuôi trong tối 48 tiếng, mẫu được rửa bằng nước cất khử trùng có kháng sinh cefotaxime 50 mg/l, sau rửa xong mẫu được làm khô và chuyển mẫu lên môi trường tạo chồi (SIM) MS0 có bổ sung BAP 1,5 mg/l, kanamycine 50 mg/l và cefotaxime 50 mg/l (Hình 3.1 C, D).
Chồi tái sinh được chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM) MS0 + BAP 1,5 mg/l BAP có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật và kháng sinh chọn lọc vector tái tổ hợp, nuôi trong thời gian 20 - 30 ngày (Hình 3.1 E).
Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 1 - 2 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ (RM) MS0 + IBA 0.2 mg/l bổ sung kháng sinh chọn lọc trong 14 ngày (Hình 3.1 F, G).
Cây tái sinh trên môi trường chọn lọc có 2 - 5 lá, có 3 - 4 rễ đã trở thành cây hoàn chỉnh (Hình 3.1 H) được chuyển ra đất trồng và để tiến hành đánh giá hiệu suất chuyển gen và phân tích cây chuyển gen (hình 3.2).
A: Mảnh lá cây thuốc lá được ngâm trong dịch khuẩn AGL1 ; B: Mảnh lá cây thuốc lá trên môi trường đồng nuôi cấy ; C: Các mảnh lá cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM trong 2 tuần ; D: Chồi sinh trương trên môi trường SIM ; E : Các chồi đang tái sinh trên môi trường SEM trong 2 tuần ; F, G : Cây tạo ra rễ trên môi trường RM ; H: cây hoàn chỉnh.
Kết quả chuyển cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT vào giống thuốc lá mô hình giống K326 trong 3 lần biến nạp với 150 mẫu và 60 mẫu đối chứng. Đối với mẫu biến nạp 150 mẫu qua 5 bước từ biến nạp gen, đồng nuôi cấy, tạo chồi, tái sinh chồi, tạo cây hoàn chỉnh và đưa cây trồng trên giá thể được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp vector mang gen CoOMT vào cây thuốc lá Đối chứng và thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo cụm chồi Số chồi tái sinh Số cây ra rễ Số cây trồng trên giá thể ĐC1 30 19 52 31 17 ĐC0 30 0 0 0 0 Thí nghiệm 1 50 14 25 14 9 2 50 33 72 40 17 3 50 22 55 30 15 Tổng 150 69 152 84 41
Ghi chú: ĐC1 là lá mầm cây thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh; ĐC0 là lá cây thuốc lá không
chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh
Trên bảng trên cho thấy với 150 mẫu cây, sau ba lần biến nạp thu được 69 mẫu tạo cụm chồi và có 152 mẫu chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc MS chứa cefotaxime, kanamycin và trong đó có 84 mẫu ra rễ, còn 41 cây trên giá thế. Trong khi đó ĐC0 là 30 mẫu không chuyển gen được nuôi trên môi trường