§3. ENZYME NUCLEASE
§1. MỘT SỐ LOẠI PROTEIN CHỨC NĂNG
Khả năng chống chịu của sinh vật nói chung và của thực vật nói riêng liên quan đến cấu trúc và chức năng của các thành phần trong tế bào. Các vùng tế
bào và các quá trình xảy ra trong mỗi vùng liên quan đến khả năng chịu hạn, nóng, mặn, phèn của thực vật (hình 5.1).
Hình 5.1. Chức năng của các vùng tế bào khi môi trường thiếu nước (theo Bohnert,Jensen, 1996 và Đinh Thị Phòng, 2001)
Hình 5.2. Hoạt động của các gene liên quan đến sự mất nước và sự thay đổi áp suất thẩm thấu (theo Bray, 1993 và Trần Thị Phương Liên, 1999).
1.1.1. Protein sốc nhiệt (HSP)
HSP có ở hầu hết các loài thực vật như: lúa mì, mạch, lúa gạo, ngô, đậu hành, tỏi.... chúng chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này. HSP còn tìm thấy ở vi khuẩn và động vật bậc cao. HSP được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực đoan như hạn, nhiệt độ cao, độ muối cao.
HSP có thể chia làm 6 nhóm dựa trên cơ sở khối lượng phân tử khác nhau: MW 110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa. Trong số đó có nhóm HSP70 và HSP60 có nhiều đại diện của chất môi giới phân tử (gọi là chaperonin). HSP8,5 hoa (ubiquytin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhưng không phải là môi giới phân tử. Ubiquytin có hoạt tính protease với chức năng phân giải các protein không có hoạt tính enzyme, ngăn chặn hiện tượng gây độc tế bào của những protein này. Ubiquytin có MW rất thấp, ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ nên ubiquytin có vai trò tự sửa chữa của tế bào khi gặp yếu tố cực đoan, đặc biệt là nhiệt độ.
1.1.2. Môi giới phân tử (MGPT)
Theo Ellis (1997) MGPT là một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau, nhưng chúng đều có chức năng tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein trong tế bào. Chức năng của MGPT thể hiện ở những nội dung sau:
- Giữ ổn định chuỗi polipeptit khi đang tổng hợp và tạo cấu trúc không gian đúng cho chúng.
- Tạo lại cấu trúc không gian của protein sau khi vận chuyển qua màng tế
bào.
- Lắp giáp các chuỗi polipeptit vào phức để tạo cấu trúc bậc 4.
- MGPT được tăng cường nhờ quá trình tổng hợp trong điều kiện cực
đoan do nhu cầu cấp thiết của tế bào.
Hoạt động của MGPT được thực hiện nhờ việc sử dụng năng lượng ATP. MGPT được nghiên cứu đầu tiên ở thực vật và liên quan đến enzyme Ribulose bisphotphat cacboxylase/oxygenelase (RUBISCO). RUBISCO xúc tác các phản
ứng tổng hợp chất hữu cơ nhờ sử dụng CO2 tự do trong quang hợp. RUBISCO có cấu trúc bậc 4 gồm từ 4- 8 tiểu đơn vị lớn (MW52) và 8 tiểu đơn vị nhỏ
(MW14 kDa). Một loại protein đặc hiệu gắn với những tiểu đơn vị chính tạo phức RUBISCO-binding protein (RBP) và RBP là MGPT.
MGPT ở thực vật tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho những phân tử protein mới được tổng hợp, chuyển protein qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự huỷ hoại protein chưa tạo cấu trúc đúng, khởi đầu sự phân giải protein bị biến tính. MGPT có thể phân thành một số nhóm chủ yếu sau: • HSP70 là nhóm MGPT có hoạt tính ATP-ase và có tính bảo thủ cao. Trong điều kiện cực đoan HSP70 có thể ngăn chặn sự co cụm và kết tụ protein.
• HSP60 (chaporonin) là loại protein cấu tạo từ các tiểu đơn vị có khối lượng 60 kDa và cũng có hoạt tính ATP-ase. Chúng có cấu tạo 2 vòng,
mỗi vòng có từ 7-8 tiểu đơn vị. Ở tế bào Prokaryot, chaperonin giống với protein tìm thấy ở ti thể, lục lạp và được gọi là GroEL, GroES. Trong tế
bào Eukaryot tìm thấy một loại chaperonin trong tế bào chất là CCT. Nghiên cứu về CCT thực vật còn ít được đề cập. Tuy nhiên gần đây đã có những công bố đầu tiến của Nông Văn Hải và cộng sự (1998), Trần Thị
Phương Liên và cộng sự (1999) về kết quả phân lập và tách được dòng gene CCT tδ ừ cây đậu tương.
1.1.3. HSP100, HSP90, SHSP
Các nhóm HSP100, HSP90, sHSP có tính bảo thủ cao và có hoạt tính ATP-ase. Phần lớn các protein này được sinh ra khi.gặp nhiệt độ cao. Chức năng của HSP100, HSP90, SHSP là ngăn chặn hiện tượng co cụm của protein và tái hoạt hoá các phân tử protein đã biến tính.
1.1.4. LEA (Late embryogenesis abundant protein)
LEA là loại protein được tổng hợp với số lượng lớn trong giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi. LEA có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu khô hạn của hạt. Cấu trúc phân tử của LEA nổi bật là giàu axit amin ưa nước, không chứa xystein, tryptophan, có vùng xoắnα và có khả năng chịu nhiệt. Chúng thực hiện các chức năng cô lập ion, bảo vệ màng, huỷ protein biến tính và điều chỉnh áp suất thẩm thấu.
LEA được chia làm 6 nhóm: nhóm 1-D19; nhóm 2-D11 (dehydrin); nhóm 3-D7; nhóm 4- D113; nhóm 5-D29; nhóm 6-D95. Nhiều gene LEA đã được nghiên cứu, phân lập và xác định chức năng. Khi gặp hiện tượng mất nước mARN của nó được tổng hợp và dần trở thành một lượng lớn gồm nhiều loại mARN khác nhau trong hạt chín, mARN bị phân giải hết khi hạt nảy mầm. Mức độ phiên mã của gene LEA được điều khiển bởi ABA và độ mất nước của tế bào.
1.2. Protein bất hoạt ribosome (Ribosome inactivating proteins - RIPs)
Protein bất hoạt ribosome (ribosome inactivating proteins - RIPs) là những độc tố (toxin) có hoạt tính rRNA N-glicosidase và các đặc tính sinh - dược học rất đa dạng. Cơ chế tác động của RIPs là phân cắt cầu nối N- glicosidic của adenine đặc hiệu trên vùng Sarcin/Ricin Loop (còn được gọi là SRL hay R/S Domain) của rRNA (vị trí A4324 trên rRNA 28S ở gan chuột). Kết quả là ribosome không gắn kết được với EF-2 và GTP, làm ức chế quá trình sinh tổng hợp protein.
RIPs được phân loại theo cấu trúc phân tử của chúng theo hai hoặc ba tipe khác nhau: (1) RIPs tipe I chỉ có một chuỗi polipeptit A (đôi khi ở dạng glicosyl hoá) với hoạt tính RIPs N-glicosidase; (2) RIPs tipe II có hai chuỗi: polipeptit A liên kết với chuỗi plipeptit B (là một phân tử có hoạt tính giống lectin) bằng một (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hoặc hơn các cầu nối disulfide; (3) RIPs tipe III giống tipe I, bao gồm một chuỗi polipeptit, nhưng lại chỉ có hoạt tính sau khi được phân cắt đoạn tín hiệu bằng một loại protease đặc hiệu.
Số lượng RIPs tipe I (khối lượng phân tử khoảng 30kDa) nhiều hơn RIPs tipe II và III. Tuy nhiên một số RIPs không thể phân loại theo các tipe kể trên. RIPs được phát hiện ở hơn 50 loài thuộc 13 họ thực vật, bao gồm cả cây một và hai lá mầm. RIPs không chỉ thấy ở họ Bầu bí (Cucurbitaceae) với rất nhiều loài là các cây thuốc quý như Trichosanthes, Luffa, mà còn thấy ở rất nhiều các họ thực vật khác như Cẩm chướng (Caryophylaceae), Thầu dầu (Euphorbiaceae), Hoà thảo (Poaceae), Họ đậu (Fabaceae), họ Hoa phấn (Nygtaginaceae)... RIPs không chỉ tìm thấy ở thực vật, mà còn thấy ở một số
loại vi khuẩn đường ruột. Sự có mặt của RIPs ở rất nhiều cơ thể sinh vật khác nhau đã đưa đến một giả định về khả năng tồn tại của loại protein tương tự ở thế
giới động vật.
§2. QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ PROTEIN