Chương 9: PHÂN LẬP GENE TÁCHDÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE
§2. TÁCHDÒNG GENE
- Tạo ra một lượng lớn bản sao một trình tự ADN xác định. - Chọn lọc một thư viện gene.
2.2. Các bước của kĩ thuật tách dòng
- Chọn và xử lí vector. - Xử lí ADN cần tạo dòng.
- Tạo vector tái tổ hợp.
- Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. - Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gene.
Hình 9.1. Quy trinh chung của kĩ thuật tách dòng gene
2.3. Thư viện bộ gene
Thư viện bộ gene là tập hợp tất cả các trình tự ADN cấu thành bộ gene đã
được gắn vào vector. Về nguyên tắc, thư viện bộ gene được thiết lập từ bất cứ tế
bào nào của sinh vật nghiên cứu.
Các bước thiết lập thư viện bộ gene:
(1) Tách chiết ADN.
(2). Cắt ADN thành những đoạn có kích thước xác định bằng RF. (3). Gắn đoạn các ADN vào vector để tạo vector tái tổ hợp.
(4). Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
Hình 9.2. Tách dòng ADN tái tổ hợp
Ứng dụng:
- Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gene, đặc biệt cấu trúc itron, exon của một gene xác định.
- Tạo dòng các trình tự không mã hoá nằm cạnh các gene và đóng vai trò quyết định trong sự điều hoà biểu hiện gene.
2.4. Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gene chaperonin ở đậu tương
Một ví dụ về xác định trình tự gene chaperonin liên quan đến tính chịu nóng hạn ở cây đậu tương Glicine max (L.) Merrill trên thiết bị tự động theo
nguyên tắc của phương pháp Sanger. Glicine max (L.) Merrill là loại cây trồng có vị trí quan trọng hàng đầu trong các loại cây họ đậu. Hạt đậu tương có hàm lượng protein cao từ 28% - 45%, dễ tan và chứa hầu hết các loại axit amin, đặc biệt là các loại axit amin không thay thế. Ngoài protein, hạt đậu tương còn có lipit và nhiều chất hữu cơ khác. Rễ đậu tương có nốt sần chứa vi khuẩn cố định
đạm Rhizobium.
Các dòng đậu tương M48, M10 và M61 được tạo ra bằng phương pháp
đột biến thực nghiệm (Chu Hoàng Mậu, 2001) đã được đánh giá và chọn lọc qua nhiều thế hệ. Ngoài các đặc điểm về năng suất và chất lượng, tác giả còn quan tâm nghiên cứu mối liên quan giữa khả năng chịu hạn với đặc điểm hoá sinh và sinh học phân tử của các dòng đậu tương đột biến này. Dòng đậu tương đột biến chịu hạn ML61 có nguồn gốc từ giống đậu tương Lạng Sơn và được tạo ra bằng
đột biến thực nghiệm với công thức xử lí phối hợp (16 kr γ + 0,01%EI). Trần Thị Phương Liên (1999) đã nghiên cứu, phân lập và xác định trình tự gene chaperonin từ giông đậu tương chịu nóng M103, genome của các dòng đậu tương đột biến ML10, ML48 và ML61 có tồn tại gene chaperonin và cấu trúc của nó có điểm gì khác với gene chaperonin đã được nghiên cứu. Kết quả nhân và tách dòng gene chaperonin của các dòng đậu tương đột biến M48, M10 và M61 và xác định trình tự gene chaperonin của dòng đậu tương chịu hạn M61
được thực hiện nhằm mục đích trên. Phát hiện gene chaperonin theo phương pháp của Kary Mullis và cộng sự (1985) với việc sử dụng cặp mồi Chap_N/chap_C thiết kế dựa trên trình tự ADN bổ sung (cDNA) của giống đậu tương Nhật Bản.
Chap_N:
5_GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C Chap_C:
5_CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA GTT ACA ATA TCA TC Chu trình nhiệt phản ứng: 950C : 1 phút; 550C : 1 phút; 720C : 1 phút 20 giây: 32 chu kì; 720C : 8 phút; Kết thúc ở 40C.
Để tiến hành tách dòng gene chaperonin sản phẩm PCR được cắt thành các đoạn nhỏ hơn bằng SacI. Sau đó đem sản phẩm cắt gắn vào vector pBluescript KS (-) đã được mở vòng. ADN tái tổ hợp được biến nạp vào chủng
E. coIi-DH5α . Môi trường nuôi cấy, các phương pháp gắn, tạo tế bào khả biến, biến nạp, tách ADN plasmid, kiểm tra đoạn gene bằng cách xử lí với enzyme giới hạn dược tiến hành theo sách cẩm nang chọn dòng phân tử của Sambrook và cộng sự 1989.
2.4.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN tổng số
Mầm 2-3 ngày tuổi của các dòng dậu tương ML10, ML48 và ML61 được chia nhỏ từ 0,5-1g và giữ ở -700C. Khi tách chiết, mầm được nghiền trong nitơ
lỏng và ADN tổng số được chiết ra bằng dung dịch đệm có chứa 10 mM Tris-
HCl pH 8.0,1 mM EDTA, 100 mM NaCl, SDS 2,1%. Sử dụng enzyme
proteinaza, hỗn hợp phenol : chlorofoc : isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để loại protein và các hợp chất không mong muốn, EDTA có tácdụng cố định các ion Mg++ - là yếu tố cần thiết cho sự hoạt động của các nucleaza, do đó ADN trong dung dịch không bị phân giải bởi các enzyme này. Thực hiện quy trình tách chiết ADN như đã mô tả [1], thu được dung dịch có chứa ADN. Dung dịch ADN thu được vẫn tồn tại cả ARN, loại bỏ ARN bằng cách xử lí với ARNaza, ủ ở 370C trong 2-3 giờ.
Sau đó tiến hành kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Bản gel sau khi điện di được nhuộm bằng EtBr (ethidium bromide) trong 10-15 phút. Do cấu trúc của ADN có các liên kết hydro giữa hai mạch đơn nên khi nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào các liên kết này. Phân tử EtBr có khả năng phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại (UV) nên có thể phát hiện băng vạch khi chiếu bản gaeldưới đèn UV.
Hình 9.3. Kết quảđiện di ADN tổng số trên gel agaroza 0,8%
2.4.2. Nhân gene chaperonin từ 3 dòng đậu tương bằng kĩ thuật PCR
Chaperonin tế bào chất là một dạng protein tồn tại trong tất cả các tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc tạo cấu trúc không gian đúng cho protein tạo khung tế bào là actin và tubulin. Chúng cùng đồng thời thực hiện nhiều chức năng khác như tham gia tái tạo cấu trúc không gian đúng cho protein bị biến tính khi gặp
điều kiện bất lợi. Các tác giả đã sử dụng đoạn mồi được tổng hợp dựa vào trình tự cDNA của chaperonin tế bào chất giống đậu tương chịu lạnh Nhật Bản để tiến hành nhân gene chaperonin của các dòng đậu tương đột biến ML10, ML48 và ML61 bằngkĩ thuật pPC.
Hình 9.4. Điện di đồ sản phẩm PCR gene chaperonin của 3 dòng đậu tương Sau 32 chu kì phản ứng, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% và kết quả cho thấy ở cả ba dòng đậu tương đều thu được sản phẩm PCR đặc hiệu. Kích thước phân tử (KTPT) của sản phẩm PCR vào khoảng 1,6 kb. Đồng thời sản phẩm PCR nhận được có KTPT giống với đoạn tương ứng
ở đoạn cDNA của gene chaperonin trong giống đậu tương Nhật Bản. Điều đó chứng tỏ rằng các dòng đậu tương nghiên cứu đều có gene chaperonin. Như vậy, trong trình tự của nó chỉ có những vùng được dịch mã sang protein (exon), mà không có những vùng không dịch mã (intron).
2.4.3. Phân tích gene chaperonin bằng enzim giới hạn
Theo các nghiên cứu đã công bố, trình tự gene chaperonin có điểm nhận biết cho một số enzyme giới hạn như: SacI, AluI, SauI. Trong đó SacI cắt trình tự cDNA thành 5 đoạn có kích thước phân tử tương ứng là 260, 189, 198, 630 và 325 bp. Như vậy, để so sánh gene chaperonin này với các trình tự công bố. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agaroza 1,2%.
Hình 9.5. Phổ điện di ADN plasmid
Kết quả trên diện di đồ cho thấy không có sự khác biệt về vị trí điểm cắt
SacI ở các dòng đậu tương đột biến so với các gene chaperonin đã được công bố
trước đây. Điều này chứng tỏ sản phẩm PCR nhận được có thể chính là đoạn gene chaperonin. Đây là một trong những bằng chứng khẳng định sản phẩm
PCR thu được chính là gene chaperonin đã được công bố. Tuy nhiên để có thể
khẳng định chắc chắn về gene này cần tiếp tục nghiên cứu tách dòng sản phẩm PCR của một đại diện là dòng đột biến ML61 - dòng được đánh giá là có năng suất cao, chín sớm và khả năng chống chịu hạn tốt để tiến hành đọc trình tự
ADN của đoạn gene này làm cơ sở cho việc so sánh với trình tự của gene chaperonin đã được công bố trên ngân hàng gene thế giới.
2.4.4. Tách dòng một số đoạn ADN của gene chaperonin ở dòng ML61
Nhằm mục đích nghiên cứu đọc trình tự gene, cần phải gắn một số đoạn ADN của gene chaperonin ở dòng ML61 đã được cắt bằng enzyme SacI vào vector pBluescript KS (-). Dựa vào các đặc điểm của vector pBluescript KS (-) có chứa gene lacZ và vị trí cắt của SacI... Đồng thời trên gene chaperonin cũng chứa vị trí các điểm cắt đặc hiệu của SacI. Vì vậy, sử dụng SacI để xử lí sản phẩm PCR của dòng đậu tương ML61 và mở vòng vector pBluescirpt KS (-). Phản ứng gắn của vector với các đoạn cắt của sản phẩm PCR được tiến hành ở
160C trong vòng 24 giờ, sử dụng enzyme T4 ligaza. Sau đó, dịch phản ứng được biến nạp vào chủng E. coli - DH5α và cấy trải trên môi trường chọn lọc có ampixillin, X-gal và IPTG. Kết quả đã nhận được một số khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh trên môi trường chọn lọc. Những khuẩn lạc trắng có thể đã mang
đoạn ADN ngoại lai, còn khuẩn lạc xanh mang plasmid không chứa đoạn gắn vào. Để kiểm tra kết quả của quá trình chọn dòng 9 khuẩn lạc màu trắng (kí hiệu các khuẩn lạc từ 1 đến 9) và một khuẩn lạc màu xanh (làm đối chứng) được sử
dụng để tách chiết ADN plasmid. Sau khi tách chiết và làm sạch, sản phẩm ADN plasmit được kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Trên ảnh điện di đồ cho thấy cả 9 khuẩn lạc đều có ADN plasmid với độ di động điện di cao hơn đối chứng.
Để xác định được những khuẩn lạc cần tìm có gắn đoạn sản phẩm PCR cắt bằng
SacI, chọn ADN plasmid từ bơn khuẩn lạc 1, 4, 7 và 8 để tiến hành phản ứng cắt kiểm tra bằng enzyme SacI. Sản phẩm sau khi cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 0,8 %.
Kết quả trên ảnh điện di dòng số 8 đã gắn được một đoạn ADN khoảng 0,6 kb; dòng số 7 đã gắn được đoạn ADN khoảng 0,4 kb; dòng số 4 đã gắn dược
đoạn ADN khoảng 0,2 kb. Riêng sản phẩm cắt của dòng số 1 cho thấy có cả 2
đoạn ADN khoảng 0,6 kb và 0,2 kb được gắn vào vector. Trong quá trình tách dòng, sử dụng enzyme SacI cắt gene chaperonin thành 5 đoạn. Vì SacI là enzyme cắt tạo đầu dính nên sản phẩm cắt chỉ cho được 3 đoạn có đầu dính tương ứng với kích thước là 189, 198 và 630 bp.
Như vậy, rõ ràng là dòng số 8 đã gắn được đoạn tương ứng có kích thước là 630 bp. Dòng số 4 thì gắn dược hoặc là đoạn 189 bp hoặc 198 bp (vì hai đoạn
này rất khó phân biệt trên diện di đồ). Còn dòng số 1 gắn được cả hai đoạn 630 bp và một trong hai đoạn ngắn nói trên. Đối với dòng số 7 đoạn gắn có kích thước khoảng 400 bp có thể là tổng của hai đoạn ngắn 189 và 198 bp và cũng có thể là đoạn lẫn tạp trong sản phẩm cắt ngẫu nhiên. Để có những kết luận chính xác về các dòng thu được, cần tiến hành đọc trình tự ADN.
2.4.5. Xác định trình tự gene Chaperonin ở cây đậu tương
Vector tách dòng TA cloning và các hoá chất cần thiết của hãng Invitrogen, vi khuẩn E. coli chủng DH5α . Tạo dòng phân tử được tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Russell. Xác định trình tự gene chaporonin
được thực hiện trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analizer. Nhân đoạn gene chaperonin từ ADN tổng số, tiểu phần CTTδ của dòng đậu tương đột biến ML61. Sau đó, sản phẩm PCR được đưa vào vector TA cloning, được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α . Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng xử lí với enzyme EcoRI đã thu được dòng mang đoạn gene mong muốn để
tiến hành đọc trình tự. Để kiểm tra kết quả đọc trình tự gene chaperonin, sử dụng phần mềm Sinh học Clustalx để so sánh trình tự gene này với các gene chaperonin của giống Cúc Vàng (còn gọi là Cúc Lục Ngạn), một giống địa phương có khả năng chịu hạn, giống M103 đột biến có khả năng chịu nóng và giống đậu tương chịu rét Nhật Bản - Bonminori.
Trình tự gene chaperonin của dòng đậu tương đột biến ML61 có sự sai khác 41 vị trí nucleotit so với giống M103, 57 vị trí nucleotit so với giống Cúc Vàng và 25 nucleotit so với giống đậu tương Bonminori. Sự sai khác này tạo nên sự thay đổi trình tự 9, 10 và 11 axit amin sai khác của ML61 tương ứng so với Bominori, M103 và Cúc Vàng.
Bảng 9.1: Trình tự axit amin của gene chaperonin ML61 sai khác so với Bonminori, Cúc Vàng và M103
STT Vị trí Bonminori Cúc Vàng M103 MI61
1 8 Gln (Q) Gln (Q) Gln (Q) His (H)
2 24 Glu (E) Asp (D) Asp (D) Glu (E) 3 29 Gli (G) Ala (A) Ala (A) Ala (A) 4 43 Thr(T) Thr(T) Thr(T) Ala (A)
5 54 Ile (1) Thr(T) Thr (I) Ile (I) 6 76 Val (V) Gli (G) Val (V) Val (V) 7 99 Ser (S) Thr(T) Thr (T) Thr (T) 8 110 His(H) Leu (L) His(H) Leu (L) 9 128 Glu Asp (D) Asp Asp 10 129 Pro (P) Ala (A) Pro (P) Ala (A) 11 191 Pro (P) Pro (P) Pro (P) Ala (A)
12 204 Val (V) Ile(I) Val (V) Val (V) 13 220 Leu (L) Pro (P) Leu (L) Leu (L) 14 280 Ser (S) Gli (G) Gli (G) Ser (S) 15 308 Ser (S) Ser (S) Ala (A) Ser (S) 16 360 Phe (F) Val (V Phe (F) Phe (F) 17 447 Asp (D) Ala (A) Ala (A) Ala (A) 18 506 Leu (L) Leu (L) Pro (P) Leu (L) 19 514 Thr(T) Met (M) Thr (T) Thr (T)
Các trình tự nucleotit sai khác còn lại đều do sự dột biến điểm có tính chất
đồng chuyển (hoán vị của các nucleotit trong nhóm với nhau) mà không làm thay đổi trình tự axit amin. Mặt khác ở dòng đậu tương MI61 còn có sự sai khác
ở 3 vị trí axit amin 8Gln-His, 29Thr-Ala và 191Pro-Ala so với cả 3 giống so sánh trên. ML61 là một dòng đậu tương đã được xử lí đột biến phối hợp với 16 kr γ + 0,01%EI, có thể chính việc xử lí phối hợp tia γ và EI đã gây nên sự đột biến trình tự nucleotit của dòng đậu tương này.
Xem xét đến 3 vùng chức năng quan trọng của chaperonin để nghiên cứu
đánh giá trình tự nucleotit của dòng ML61 đến việc tạo cấu trúc không gian của chaperonin. Vùng hoạt tính ATPaza và vùng gắn với ATP, đây là hai vùng bảo thủ của gene. Vùng hoạt tính ATPaza vẫn giữ dược tính bảo thủ, còn vùng gắn với ATP ở ML61 sai khác với Bominori ở vị trí 99Thr-Ser và M103 99Thr - Ile. Cúc Vàng có trình tự vùng này giống ML61. Một vùng thứ 3 được kiểm tra là vùng gắn cơ chất với phức CCT, đây là vùng đa hình nhất so với các vùng chức năng khác của chaperonin tiểu phần CCTδ . Trong vùng này ML61 sai khác với M103 ở vị trí axit amin 280Gli-Ser, Cúc Vàng ở hai vị trí 220Pro-Leu và 280Gli-Ser. Không có sự thay đổi của vùng này so với Bominori. Ngoài ra để đánh giá khả năng chịu hạn của ML61, trình tự gene chaperonin này được xem xét theo quy luật biến đổi các axit amin trong các enzim về khả năng chịu lạnh sang nóng. Dựa trên trình tự axit amin, dòng ML61 cũng có sự biến đổi tương tự ở vị trí axit amin 29 Gli-Ala, 99Ser-Thr (Bominori) giống như Cúc Vàng và M103. Hai giống đậu tương đã được đánh giá là có khả năng chịu hạn.
2.5. Thư viện cADN
Thư viện ADN là tập hợp các bản sao cADN từ tất cả các mARN của tế
bào. Khác với thư viện bộ gene, thư viện cADN được thiết lập từ một tế bào xác
định trong đó gene nghiên cứu biểu hiện thành mARN.
Mục đích của thư viện cADN là nghiên cứu biểu hiện một gene xác định cùng với những vấn đề liên quan như biểu hiện gene, mối tương tác giữa các gene trong quá trình sống.
Các bước thiết lập thư viện cADN: (1) Chọn vector.
(2). Tách chiết mARN.
(3). Tổng hợp cADN nhờ enzyme sao mã ngược. (4) Tạo vector tái tổ hợp gồm plasmid và cADN. (5) Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn.
(6) Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng, sau chuyển sang đặc. Các dòng vi khuẩn sẽ hình thành các khuẩn lạc.
Hình 9.6. Tạo vector cADN tái tổ hợp (theo Nông Văn Hải, 2002)
2.6. Phát hiện dòng tế bào chủ chứa vector tái tổ hợp
Vector và đoạn ADN ngoại lai được trộn lẫn với nhau dưới tác dụng của