§3. ENZYME NUCLEASE
§3. KĨ THUẬT PHÂN TÍCH PROTEIN
Protein có tính tan trong nước và muối, do vậy người ta chiết protein bằng một số loại dịch chiết có độ pH khác nhau kết hợp với phương pháp li tâm thu
dịch chiết. Sau đây trình bày cách chiết protein sử dựng cho định lượng và điện di protein.
3.1.1. Tách chiết protein dự trữ trong hạt thực vật
Protein dự trữ trong hạt có thể được chiết bằng các loại dịch chiết như
nước cất, NaCl, dung dịch đệm phosphat xitrat pH = 10... Đối với các loại hạt có dầu thì trước khi chiết protein cần phải loại lipit, ví dụ kĩ thuật loại loại lipit ở
hạt đậu tương hoặc đậu xanh: Hạt đậu bóc vỏ, bỏ phần phôi mầm sau đó nghiền nhỏ. Bột nhận được giữ ở 40C. Loại lipit bằng petrolium ete qua đêm ở 40C. Li tâm 14.000 vòng/phút để loại dịch li tâm. Lặp lại một vài lần nữa. Bột đã loại lipit giữ ở 40C.
3.1.1.1. Chiết protein dùng để phân tích định lượng hoặc điện di
Bột đã loại lipit được sử dụng chiết protein tổng số bằng dung dịch NaCl 1M pH = 7.0, chiết bằng nước cất pH = 7.0 hoặc chiết bằng đệm photphat pH=10. Bột đã loại lipit được chiết bằng dung dịch đệm qua đêm ở 40C, trong 24 giờ. Ngày hôm sau li tâm 14.000 vòng/phút trong 30 phút thu dịch phía trên. Dịch li tâm thu được chứa protein tổng số bao gồm albumin và globulin. Trong
định lượng protein có thể tiến hành lặp lại nhiều lần; còn trong phân tích điện di thì có thể thực hiện một lần. Dung dịch protein được giữ ở -200C.
3.1.1.2. Chiết phân đoạn protein cho phân tích điện di
Tách chiết và phân đoạn protein theo phương pháp Osborne và Klimenko. Có thể lấy ví dụ ở cây họ đậu: Hạt được nghiền nhỏ thành bột mịn, loại lipit bằng ete petroleum sau đó tiến hành phân đoạn. Protein được chiết bằng dung dịch NaCl 1M và nước cất.
Theo cách thứ nhất, bột đã loại lipit được chiết bằng NaCl 1M sau đó li tâm 14000 vòng/phút trong 20 phút. Dịch li tâm chứa albumin và globulin tổng số (phân đoạn I). Cặn li tâm chứa tinh bột và tạp chất được loại bỏ. Tiếp theo albumin và globulin tổng số được phân đoạn bằng cách thẩm tích, sau đó li tâm. Dịch li tâm thu được chứa phần lớn albumin (phân đoạn II). Cặn li tâm là các protein không tan trong nước mà tan trong NaCl. Phần này được hoà vào NaCl 1M (phân đoạn III).
Theo cách thứ hai, protein được chiết bằng nước cất sau đó li tâm. Dịch li tâm chứa phần lớn albumin và một phần globulin (phân đoạn IV).Cặn li tâm
được chiết tiếp bằng NaCl 1M và li tâm lấy dịch (phân đoạn VII) Phân đoạn IV
được xử lí tiếp bằng thẩm tích. Dịch li tâm chứa phần lớn albumin (phân đoạn V). Cặn li tâm chứa phần lớn globulin tan trong NaCl 1M (phân đoạn VI).
3.1.2. Tách chiết protein trong mô động vật
tương tự như ở thực vật. Protein trong mô động vật được chiết nhờ muối hoặc nước và bằng li tâm.
3.2. Định lượng protein
3.1.1. Phân tích hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Keldjal
Nguyên tắc : Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nhờ nitơ tổng số. Nitơ có trong thành phần axit amin của protein là nitơ
protein. Nitơ không có trong thành phần protein như muối vô cơ, axit nitric... là nitơ phi protein. Nitơ tổng số = nitơ protein + nitơ phi protein. Oxi hoá nguyên liệu bằng H2SO4 có mặt chất xúc tác và nhiệt độ cao, kết quả của việc công phá mẫu này là đạm trong thành phần chất hữu cơ chuyển thành (NH4)2SO4, dưới tác dụng kiềm mạnh, nóng NaOH, sục NH3 bay lên gặp nước tạo thành NH4OH, NH4OH được H2SO4 thụ, Sau đó chuẩn độ lượng NH3được H2SO4 bằng NaOH.
Kết quả phân tích sẽ thu được hàm lượng mía nitơg số bao gồm cả mùi nitơtein và nitơ phi protein. Do vậy cần tiến hành phân tích hàm lượng nitơ phi protein để xác định hàm lượng nitơ protein mà chúng ta quan tâm trong đánh giá chất lượng sản phẩm sinh học.
Xác định hàm lượng nitơ phi protein có thể được xác định theo phương pháp của Barstein trên máy phân tích đạm tự động Vapodest của hãng Gerhardt và máy Kjeldahl.
Hàm lượng nhơ pitotein = Hàm lượng nitơ tổng số - Hàm lượng nitow phi protein
3.1.2. Phân tích hàm lượng protein tan tổng số
Nguyên tắc chung là sử dụng các thuốc thử như Folin, Bradford, Gordan... với sự hấp thụ ở những bước sóng khác nhau trên máy quang phổ Uvis Đồng thời với sự phân tích mẫu thí nghiệm là sử dụng protein chuẩn đã biết trước hàm lượng để tính hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm.
• Phương pháp định lượng protein tan tổng số theo phương pháp Lowry. Cơ sở của phương pháp là sự hình thành phức chất biurê. Phức này tham gia với thuốc khử Folin-ciocalteu để cho màu đặc trưng. Cường độ màu tỉ lệ với hàm lượng protein. Đo cường độ màu của hỗn hợp trong ống nghiệm trên máy so màu quang điện ở bước sóng λ = 750nm. Sau khi đo được mật độ quang thì
đem đối chiếu với đồ thị chuẩn để tìm lượng protein tương ứng. Thí nghiệm để
xây dựng đồ thị chuẩn thì dịch phân tích là dung dịch của một loại protein cụ thể
(ởđây là Albumim) đã biết trước hàm lượng.
• Phương pháp sử dụng thuốc thử Bradford
nước cất; protein chuẩn.
Các bước tiến hành:
- Pha thuốc thử Bradford.
- Sử dụng protein chuẩn và thuốc thử Bradford để xây dựng đường chuẩn và đo trên máy quang phổ ở bước sóng 595nm.
- Căn cứ vào đường chuẩn xây dựng được sẽ xác định được hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm.
Ví dụ:
Từ kết quả đo trên máy quang phổ, sử dụng máy vi tính theo chương trình excel lập đường hồi quy tuyến tính y = ax +b (y : mật độ quang; x : hàm lượng protein).
Căn cứ vào đồ thị chuẩn y = 1,039. x + 0,0031 sẽ tính được hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm.
Giả sử khi đo mẫu thí nghiệm với thuốc khử Folin-Ciocalteu trên máy quang phổ ở bước sóng 750nm được trị số y = 0,234 thì thay vào phương trình y = 1,039. x + 0,0031 ta được hàm lượng protein : x = (0,234 - 0,0031)/1,039 = 0,22 mg/ml.
Tuy nhiên, khi phân tích trên máy quang phổ bởi phương pháp Bradford hoặc Lowry thì căn cứ vào các số liệu lập đường chuẩn với albumin nguyên chất máy tự động lập phương trình và tính toán cho ta kết quả về hàm lượng protein.
3.3. Phân tích thành phần axit amin
Xác định hàm lượng từng loại axit amin trong mẫu thí nghiệm bằng phương pháp sắc kí trên giấy hoặc hiện nay thường sử dụng máy phân tích axit amin tự động Biochrom 20 của hãng Pharmacia Biotech hoặc trên máy HP- Amino - Quant (Amino quant Series II - Operotor Handbook). Sử dụng OPA (ortho-phthaladehyde) tạo dẫn xuất đối với axit amin bậc I và FMOC (9- Fluoreryl methyl chlorofarmate) đối với các axit amin bậc II. Mẫu được xử lí theo phương pháp thủy phân ở 1050C trong 24 giờ.
Tuỳ theo mục đích nghiên cứu mà có thể xác định hàm lượng axit amin tự
do hoặc liên kết. Trong mục đích nghiên cứu tìm mối liên quan giữa hàm lượng của một loại axit amin nào đó với đặc tính chống chịu hoặc với tính trạng chất lượng (tính thơm của hạt thực vật chẳng hạn) thì có thể xác định hàm lượng axit amin tự do trong tế bào. Còn nếu mục đích nghiên cứu là đánh giá chất lượng protein của sản phẩm thì xác định hàm lượng axit amin liên kết. Căn cứ vào hàm lượng protein và hàm lượng từ loại axit amin xác định được thành phần axit amin trong protein. Thành phần axit amin trong protein được tính theo gam axit
amin/100g protein.
3.4. Kĩ thuật điện di protein
Các loại protein có khối lượng phân tử khác nhau, do vậy chúng có tốc độ
di chuyển khác nhau trong điện trường, vì thế có thể tách được các loại protein nhờ phương pháp điện di. Từ kết quả phân tích thành phần điện di mà người ta có thể đạt được những mục đích nghiên cứu khác nhau. Kĩ thuật điện di protein bao gồm phương pháp điện di một chiều và điện di hai chiều. Các kĩ thuật này cho phép phân tách hỗn hợp phức hệ protein thành những tiểu phần khác nhau dựa trên nguyên tắc tốc độ dịch chuyển khác nhau theo khối lượng phân tử của các tiểu phần đó. Nhờ kĩ thuật điện di một chiều người ta có thể tách được các tiểu phần protein trong protein tổng số tan trong dung dịch NaCl 1M và protein tan trong nước. Dựa vào các băng điện di có thể so sánh thành phần điện di giữa các mẫu nghiên cứu, xác định tính đa dạng sinh học trên cơ sở hiện tượng đa hình protein. Bằng phương pháp điện di protein SDS-PAGE người ta đã phát hiện những sai khác về các băng điện di ở kích thước phân tử 10-16kDa giữa các thể đột biến ở 5 giống lúa khác nhau, xác định được sự khác nhau về thành phần và hàm lượng protein chiết từ lá cây 10 ngày tuổi của 12 thểđột biến đậu tương. Các kết quả nghiên cứu về thành phần điện di protein dự trữ trong hạt đậu tương và trong hạt nảy mầm, nghiên cứu thành phần diện di enzym protease trong hạt nảy mầm của các giống dậu tương chịu hạn khác nhau cho thấy mối liên quan giữa sự thay đổi phổ điện di với khả năng chống chịu của giống đậu tương này. Kĩ thuật điện di protein hai chiều giúp cho các nhà sinh học phân tử phân tách các tiểu phần protein) định tính và định lượng các loại pohpeptide. Kỹ thuật điện di còn được ứng dụng để xác định các thể đột biến, xác định sự đa hình protein. Về mặt lí thuyết kĩ thuật điện di hai chiều có thể phát hiện hai loại đột biến: (1)
đột biến do có sự thay thế một hay nhiều nucleotit, mất cặp nucleotit; (2) đột biến do sự biến đổi trình tự nucleotit. Ngoài ra: kĩ thuật điện di protein 2 chiều trên gel poliacrylamid còn được ứng dụng trong việc nghiên cứu biểu hiện gene
ở giai đoạn phát triển sớm của cây. xác định được nhiều chỉ thị protein liên quan
đến các tính trạng hình thái khác của cây trồng... Kĩ thuật điện di protein có thể
theo các bước sau:
điện di protein (ví dụ gel poliacrylamid). Tra dịch chứa protein đã biến tính vào "giếng" trên bản gel poliacrylamid, đặt hai đầu mép gel lên diện trường, chạy
điện di với hiệu điện thế khác nhau trong 1,5 - 2 giờ. Gel được cố định bằng tricloaxetic, ngâm vào dung dịch nhuộm màu coosmasie blue R-250. Sản phẩm
điện di protein được chụp ảnh để phân tích.
Thiết bịđiện di bao gồm: máy điện di và bộ nguồn (hình 5.4). Máy điện di có thể là điện đi đứng hoặc điện di ngang.
Gel sử dụng điện di protein hoặc phân tích điện di các enzyme có thể là poliacrylamid chứa SDS hay không có SDS. Ngoài ra có thể là gel thạch agar, gel agarose... Bảng 5.1. Thành phần của gel poliacrylamid Thành phần nhân bản gel % gel H2O (ml) 30% Degassed acylamid/Bis (ml) Gel buffer (ml) SDS (ml) Gel cô mẫu 4% 6,1 1,3 2,5 0,1 Gel phân tách protein 12% 3,4 4,0 2,5 0,1
Kĩ thuật chế gel điện di protein bao gồm các bước: (1) Lắp ráp khuôn gel; (2) tạo gel; (3) đổ gel.
Hình 5.4. Thiết bị phân tích điện di protein
Phân tích hình ảnh điện di protein cho kết quả thống kê các băng điện di của các đối tượng nghiên cứu, từ đó xác định được tính đa hình protein của các
điện di protein đặc trưng và tìm được mối liên quan giữa tiểu phần protein với
đặc tính quan tâm nghiên cứu. Công việc tiếp theo là phân tách tiểu phần protein từ bản gel và thu nhận tiểu phần protein bằng những thao tác khác nhau. Tiểu phần protein được đem phân tích khối phổ để xác định cấu trúc và tiểu phần protein cũng được xác định thành phần và trình tự axit amin của tiểu phần protein đó. Ngoài kĩ thuật điện di một chiều người ta có thể sử dụng phương pháp điện di hai chiều và thu nhân tiểu phần protein cũng theo nguyên tắc trên.
Hình 5.5. Hình ảnh phổ điện di protein chiết bằng nước cất
(M. marker. 1. Mỡ giống gốc; 2. MX10; 3. MXU21; 4. MXE01: 5. MX1608, 6. MX1103; 7. Tiêu giống gốc; 8. TXU21; 9. TX16012. (Æ : băng mất đi Å : băng
xuất hiện mới )
Hình 5.6. Sơđồ phân tích tiểu phần protein phân tách từ bản gel điện di
§4. KĨ THUẬT PHÂN TÍCH ENZYME