Chương 9: PHÂN LẬP GENE TÁCHDÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE
§1. PHÂN LẬP GENE
hành theo phương pháp sử dụng enzyme cắt hạn chế hoặc bằng phản ứng chuỗi PCR. Phân lập gene mang ý nghĩa trong kĩ thuật giải trình tự ADN hay tạo dòng ADN tái tổ hợp trong kĩ thuật chuyển gene.
1.1. Phân lập gene bằng kĩ thuật cắt hạn chế
Enzyme giới hạn (restrition enzyme) có khả năng cắt ADN ở những điểm
đặc hiệu. Với đặc tính đó người ta đã vận dụng để xác định những đoạn ADN mã hoá cho các tính trạng của sinh vật và phân lập đoạn ADN đó. Kĩ thuật phân lập gene nhờ enzyme giới hạn có thể gồm các bước sau:
(1). Tách chiết và tinh sạch ADN. (2). Cắt ADN bởi enzyme giới hạn. (3). Điện di trên gel agarose.
(4). Dựa vào ADN marker xác định được đoạn ADN cần phân lập.
lai phân tử. Vị trí các đoạn ADN được giữ nguyên.
(6). ADN cố định trên màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ
Rửa để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp.
(7). Dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai ADN- mẫu dò.
1.2. Phân lập gene bằng kĩ thuật PCR
Phản ứng chuỗi polimerase được tiến hành với các primers có trình tự biết trước. Cặp primer gồm primer xuôi (sens primer) và ngược (antisens primer)
được thiết kế theo trình tự gene từ ngân hàng gene. Cặp mồi chuyên biệt này
được bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN. Sử dụng cặp mồi chuyên biệt cùng với ADN mẫu, enzyme, dNTP, Mg++, bufpher... trong thiết bị
nhân ADN (máy PCR) thì đoạn gene từ phân tử ADN mẫu sẽđược khuếch đại. Phân lập gene bằng PCR có thể được tiến hành theo các bước sau: (1) Tách chiết và tinh sạch ADN.
(2). Thiết kế primers.
(3). Chọn điều kiện phản ứng PCR.
(4). Nhân đoạn ADN trong máy PCR để phân lập đoạn gene theo mục
đích.
§2. TÁCH DÒNG GENE