§3. ENZYME NUCLEASE
§2. LAI PHÂN TỬ
cứu cấu trúc ADN hệ gene (gencomic ADN). Phân tử ADN bị phân cắt bởi enzyme giới hạn thành những phân đoạn ADN riêng biệt. Bằng phương pháp
điện di các phân đoạn ADN này với những kích thước khác nhau được tách ra (separate) trên gel thạch hoặc hoặc poliacrylamit và được chuyển sang màng lai phân tử. Quá trình lai phân tử xảy ra giữa phân tử ADN và đoạn dò ADN có gắn nhãn phóng xạ theo quy tắc liên kết bổ trợ. Các đoạn ADN đặc thù được phát hiện theo phương pháp thẩm tách của Southern và phương pháp lai phân tử với
đoạn dò ADN có trình tự nucleotit tương đồng. Phương pháp tự ghi phóng xạ
(autoradiogrophy) có thể nhận biết vị trí đoạn dò ADN trên màng lai phân tử. Từ
khi E.M Southern thuộc Trường Đại học tổng hợp Edinburgh phát hiện ra kĩ
thuật này (1975) gọi là kĩ thuật phân tích màng thấm truyền Southern (Southern
blot analisis) gọi tắt là Southern, nó đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền. Khi ứng dụng kĩ thuật Southern
đối với ARN thì gọi là Northern, còn với protein thì được gọi là Western. Hiện nay đã có nhiều cải tiến về phương pháp, hình thành nhiều kĩ thuật phối hợp như
2.1. Phương pháp Southern blot
Sử dụng một trình tự ADN biết trước lai với đoạn ADN cần tìm. Các bước tiến hành có thể thực hiện theo các bước sau:
- Cắt ADN bởi enzyme giới hạn thành các đoạn ADN nhỏ có thể dịch chuyển trên gel agasore.
- Biến tính các sợi ADN kép trên gel agarose bằng phương pháp xử lí với kiềm.
- Chuyển ADN đã biến tính sang màng nylon hoặc nitrocellulose.
- Lai với trình tự ADN đã được đánh dấu bằng phóng xạ hoặc huỳnh quang.
Hình 6.7. Sơđồ mô tả phương pháp Southern blot
Phương pháp Southern blot cho phép xác định được trình tự đoạn ADN cần tìm, có thể phát hiện được đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn khi so sánh cá thể đột biến với cá thể bình thường.
2.2. Phương pháp Northern blot
Phương pháp Northern blot tương tự như phương pháp Southern blt, nhưng mục tiêu của phương pháp Northern blot là nghiên cứu cấu trúc của mARN. Đó là kỹ thuật lai giữa mARN với trình tự ADN biết trước, đánh dấu phóng xạ.
(1) Tách chiết ARN tổng số và biến tính.
(2). ARN được chuyển sang màng và lai với trình tự ADN đặc hiệu.
(3). Vị trí và số lượng các đoạn của ARN lai với ADN được phát hiện trên phim phóng xạ.
Phương pháp Northern blot cho phép nghiên cứu cấu trúc ARN, phát hiện
§3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA ADN