§3. ENZYME NUCLEASE
phân đoạn ADN)
trong lĩnh vực thú vị nhất là việc sử dụng các đoạn ADN phân lập như các chỉ
thị phân tử. Kĩ thuật phân tích hiện đa hình của độ dài các phân đoạn ADN là một kĩ thuật mới mẻ đầy hứa hẹn làm thay đổi hoàn toàn một số lĩnh vực trong
đi truyền và chọn giống.
Thông tin di truyền được chứa trong các chuỗi ADN của các nhiễm sắc thể nhân và bộ gene của các cơ quan tử. Cây trồng có khả năng sao chép phân tử
ADN với chế độ chính xác cao và mau lẹ song có nhiều tác động tự nhiên và nhân tạo gây ra biến dị trong trình tự ADN. Những biến đổi về cặp bazơ nitơ có thể xuất hiện hoặc do biến đổi chuỗi ADN trên phạm vi rộng lớn như là kết quả
của sự đảo đoạn, chuyển đoạn và khuyếtđoạn hoặc do chuyển chỗ trong nhiễm sắc thể. Có một số cách xác định biến dị của chuỗi ADN, đó là xác định trình tự
ADN và so sánh từng đoạn; sử dụng enzyme cắt hạn chế để cắt ADN thành những phân đoạn có chiều dài khác nhau.
Hình 6.11. Thiết bị tựđộng xác định trinh tự ADN mao quản
Biến đổi trình tự nucleotit tại một locus dẫn đến xuất hiện bằng ADN mới trên gel thạch hoặc poliacrylamid. Hiện tượng này được gọi là đa hình của độ
dài các phân đoạn ADN. Hiện tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN là các chỉ
thị phân tử. Bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử đó (chỉ thị phân tử RFLP) các nhà sinh học phân tử và di truyền chọn giống có thể thiết lập các bản đồ gene liên kết di truyền và định vị các gene có tầm quan trọng về kinh tế.
(1). Tách ADN từ mô sống.
(2). Sử dụng các enzyme cắt hạn chế để cắt ADN thành các đoạn có kích thước khác nhau.
(3). Điện di trên gel agarose.
(4). So sánh các đoạn ADN giữa các đối tượng nghiên cứu.
4.1. Bản đồ RFLP
4.1.1. Nguyên lí
Nguyên lí của kĩ thuật này dựa trên sự khác biệt tự nhiên của các chuỗi nucleotit trong phân tử ADN và khi phân tử ADN bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ
bởi enzyme cắt hạn chế thì các đoạn ADN có thể khác nhau về kích thước hay chiều dài. Sự khác nhau này có thể được khai thác để phân tích sự phân li của các đoạn nhiễm sắc thể khi lai tạo.
Các phân tử ADN có kích thước nhỏ như ADN lục lạp có thể sử dụng enzyme (RE) giới hạn để lập bản đồ RFLP, tuy nhiên khả năng ứng dụng ADN lục lạp trong tạo giống rất hạn chế, vì hầu hết các gene có ý nghĩa kinh tế quan trọng lại nằm trong nhân. Phân tích RFLP có thể ứng dụng với ADN nhân, nhưng rất phức tạp vì ADN nhân có kích thước lớn và hàm lượng nhiều. Khi sử
dụng RE đối với ADN thì hàng triệu phân đoạn ADN được tạo thành.
4.1.2. Thư viện chỉ thị RFLP
Người ta dùng những đoạn nhiễm sắc thể làm chỉ thị đánh dấu để nhận biết các phân đoạn cắt hạn chế. áp dụng phương pháp lai ADN - ADN có tính
đặc hiệu cao bởi việc sử dụng các đoạn ADN mẫu để nhận biết các phân đoạn ADN nhân từ hỗn hợp các đoạn ADN tạo thành bởi việc xử lí RE. Tập hợp các
đoạn ADN mẫu đó được gọi là thư viện RFLP. Đoạn ADN mẫu có độ dài 2-5 kb
ở trạng thái tinh khiết và được sử dụng để lai phân tử. Các đoạn ADN tinh khiết người ta cần phải thực hiện kĩ thuật nhân gene (gene cloning). Kĩ thuật nhân
đoạn ADN có thể được hiện như sau: Đoạn ADN được gắn vào plasmit rồi biến nạp vào vi khuẩn. Vi khuẩn sinh sản dẫn đến đoạn ADN được nhân lên tạo nhiều bản sao đoạn ADN. Bằng kĩ thuật nuôi cấy và phân lập plasmit từ vi khuẩn sẽ tạo ra một số lượng lớn các đoạn ADN dùng làm mẫu cho lai ADN. Quy trình xác định RFLP được thực hiện theo các bước sau : (1) Tách chiết ADN nhân ; (2). Xử lí ADN với enzyme cắt giới hạn ; (3). điện di sản phân cắt bởi RE ; (4). Biến tính ADN thành dạng sợi đơn; (5). Chuyển lên màng lai nitrocellulose (Southern blot) đểđoạn nADN mẫu lai với đoạn ADN tương đồng theo nguyên tắc bổ sung giữa các cặp bazơ. Người ta sử dụng kĩ thuật phát quang hoá học (Enhanced Chemical Luminesence = ECL) hoặc đánh dấu phóng xạ để xác định kết quả lai bằng phim âm bản hoặc bằng phóng xạ tự ghi.
4.1.3. Thiết lập bản đồ di truyền RFLP
Người ta tiến hành lai hữu tính được F1 và cho F1 tự thụ cho F2. Khi F1 giảm phân hình thành giao tử thì các nhiễm sắc thể có sự tái tổ hợp thông qua trao đổi chéo. Trao đổi chéo dẫn đến tái tổ hợp là cơ sở cho việc thiết lập bản đồ
di truyền truyền thống (bản đồ liên kết). Kĩ thuật RFLP cho phép quan sát trực tiếp các phân tử chỉ thị ADN trên đoạn nhiễm sắc thể. Các chỉ thị RFLP phân li hoàn toàn chính xác như các chỉ thị gene và tuân theo các định luật Menđen một cách nghiêm ngặt. Vì thế bản đồ RFLP được thiết lập theo nguyên tắc như đối với các chỉ thị truyền thống. Quy trình thiết lập bản đồ di truyền bằng chỉ thị
RFLP được thực hiện theo các bước sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(1) Chọn cặp bố mẹ cùng loài xa nhau về mặt di truyền tạo F1. Tách ADN và sử dụng RE xử lí ADN. Sàng lọc tính đa dạng và cặp bố mẹ nào có mực độ đa dạng thích hợp được chọn làm cặp lai.
(2). Tạo quần thể lập bản đồ. Cho cặp bố mẹ lai với nhau được F1, cho F1 tự phối được F2 hoặc có thể lai ngược. Một quần thể F2 hoặc lai ngược có 50 cá thể thì có thểđủ xây dựng bản đồ di truyền chi tiết.
(3). Đánh giá RFLP trong quần thể. Tách ADN từng cá thể và tiến hành kĩ
thuật RFLP. Quá trình lập bản đồ được tiến hành theo 3 quá trình sau:
- Sàng lọc RFLP: Mẫu được thử với cặp bố mẹ để phát hiện ra loại enzyme giới hạn thích hợp tạo ra sự đa dạng RFLP rõ rệt nhất giữa hai cá thể bố
mẹ.
- Chọn cặp chỉ thị 1enzyme: Chọn cặp chỉ thị /enzyme thích hợp, đó là loại enzyme cắt ADN. Có thể tiến hành như sau: tách ADN ở cây bố, cây mẹ và từng cây con để lập bản đồ. Sử dụng từng loại enzyme cắt, điện di, thấm truyền lên màng lai (mỗi enzyme dùng một bộ màng lai riêng), chọn cặp chỉ thị / enzyme thể hiện sựđa dạng về kiểu gene sẽ dùng để lập bản đồ.
- Đánh giá mức độ liên kết: Khi so sánh hai chỉ thị thu được hai kết quả, (1). Chúng có xu hướng cùng phân li và hai chỉ thị có mối liên kết. Ví dụ: F2 dị
hợp về chỉ thị 1 và dị hợp về chỉ thị 2 trong khi bố mẹ đồng hợp về cả hai chỉ
thị. (2). Sự phân bố tính đồng hợp hay dị hợp của hai chỉ thị là không theo quy luật mà hoàn toàn ngẫu nhiên, như vậy chúng không liên kết. Sử dụng nhiều chỉ
thị sẽ xác định được mức độ liên kết khác nhau của từng chỉ thị và nhóm chỉ thị.
4.2. Ứng dụng của RFLP
Việc phát triển kĩ thuật phân tính hiện tượng đa hình của độ dài các phân
đoạn ADN đã mở rộng cánh cửa đi tới phát hiện, theo dõi và điều khiển sự biến dị di truyền ở nhiều loại cây trồng mà trước đây không thể làm được (Tanksley
và cộng sự, 1989). Những nghiên cứu gần đây về lúa (Mc Couch và cộng sự, 1988), cà chua (Pettersun và cộng sự, 1988, 1990, 1991), đậu tương (Keim và cộng sự, 1990), lúa mì (Sharp và cộng sự, 1989), Ngô (Burr và cộng sự, 1988, Grant và cộng sự 1989, Beavis và cộng sự. 1991, Stuber và cộng sự, 1992) đã chứng tỏ rằng việc lập bản đồ các chỉ thị phân tử RFLP là một phương pháp có sức mạnh lớn lao trong việc xác định các locus điều khiển các tính trạng số
lượng - các đặc tính có tầm quan trọng về mặt nông nghiệp.
Người ta cũng xác định nhiều tính trạng đơn gene ở cây lúa thông qua liên kết với các chỉ thị phân tử RFLP (Mackill và cộng sự, 1993, Ronald và cộng sự, 1992, Mc Couch và Tanksley, 1991, Yu và cộng sự, 1991, Yoshimura và cộng sự, 1992). Kĩ thuật phân tích hiện tượng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN cho phép phát hiện hiện tượng đa hình của bộ gene thông qua so sánh các bản đồ
phân cắt ADN giữa các cá thể khác nhau. Các chỉ thị phân tử RFLP mang tính chất riêng biệt, đồng trội và không gây hại. Các chỉ thị phân tử này không chịu tác động bởi điều kiện môi trường (kể cả sự thay đổi về mùa vụ và vị trí địa lí và giai đoạn phát triển của cây. Việc phân tích hiện tượng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN được tiến hành trên phân tử ADN tách chiết từ lá non, tránh việc phải chăm sóc cây còn non tới lúc trưởng thành.
Người ta đã áp dụng các chỉ thị phân tử RFLP vào công tác chọn giống gián tiếp, làm rút ngắn quá trình chọn lọc các gene quý hiếm, các gene có tầm quan trọng về kinh tế. Bởi lẽ các chỉ thị phân tử RFLP có thể liên kết chặt chẽ
với các gene trên và vẫn được duy trì trong quá trình phân li. Vì vậy người ta có thể theo dõi và chọn lọc các gene thông qua các chỉ thị phân tửđó.
N. R. Apuyru và cộng sự (1988) đã xác định hiện tượng đa hình của độ
dài các phân đoạn ADN của hai giống đậu tương hoang dại Minsoy và Norin 1 bằng cách sử dụng các dòng ADN chọn lọc ngẫu nhiên làm đoạn dò ADN. Các tác giả đã nhận thấy rằng một trong số năm đoạn dò thử nghiệm đã bộc lộ tính
đa hình. Hơn nữa số băng đa hình xuất hiện là do có sự sắp xếp lại phân tử
ADN. P. Kềnh và cộng sự (1989) đã khảo sát 58 giống đậu tương chọn lọc từ
Geneus Glicine và Subgeneus Soja bằng 17 chỉ thị phân tử RFLP để đánh giá mức độ đa dạng phân tử, tính hữu hiệu của các chỉ thị phân tử được thể hiện ít nhất trong số các giống đậu tương dạng trồng và nó được biểu hiện nhiều nhất giữa các giống thuộc các loài đậu tương khác nhau như Glicine max (L) Merr, G. soja Sieb và Zucc.
Các chỉ thị phân tử RFLP được áp dụng cho việc lập bản đồ gene, nghiên cứu đa dạng sinh học, phân loại phát sinh chủng loại cho đến điều khiển vật nuôi cây trồng. Nó là một công cụ đắc lực trong công tác lai tạo và chọn giống thực
vật. Đồng thời việc xác lập các chỉ thị phân tử RFLP đã mở ra một hướng mới là phân lập các gene mà vẫn chưa biết sản phẩm của nó.
THẢO LUẬN
1. Thế nào là lai phân tử? Phân biệt phương pháp Southern blot, Northern blot. Những ứng dụng của các phương pháp này.
2. Vấn đề xác định trình tự ADN. Nguyên tắc và phương pháp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chương 7
PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE(POLIMERASE CHAIN REACTION - PCR)
Tóm tắt: Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (Polimerase chain reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên được Mullis và cộng sự mô tả năm 1986 và cũng chính do sự phát minh này mà Mullis đã xứng đáng nhận giải thưởng Nobel về Y học và Sinh lí học năm 1993. Phản ứng chuỗi polimerase (PCR) là kĩ thuật cơ bản và rất quan trọng trong Sinh học phân tử. Phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn chính: (1). Biến tính ADN mẫu; (2). Tiếp hợp mồi, (3). Tổng hợp đoạn ADN mới. PCR cũng như các kĩ thuật sinh học phân tử
khác cần phải có ADN tinh sạch và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Hiện nay
đã có nhiều phiên bản của PCR như RT-PCR, RAPD, AFLP... PCR và các kĩ
thuật cải tiến từ PCR có nhiều ứng dụng trong thực tiễn, như: sản xuất mẫu dò, khuếch đại số lượng các đoạn ADN và ARN, định lượng bằng PCR, phân tích
đột biến, phân tích ADN đa hình, phân lập gene và tách dòng gene, phân tích sinh vật chuyển gene, xác định quan hệ di truyền...
Nội dung của chương gồm 3 vấn đề cơ bản: (1). Phản ứng chuỗi polimerase (PCR); (2). Phân tích tính đa hình của ADN được nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polimorphic DNA - RAPD); (3). Phân tích tính đa hình chiều dài các phân đoạn ADN được nhân bản có chọn lọc (Amplifed Fragment Length Potimorphism - AFLP).
§1. PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (PCR)