§3. ENZYME NUCLEASE
§3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA ADN
- Kĩ thuật điện đi phân đoạn đánh dấu đầu cuối cho phép xác định trình tự
chuỗi ADN sợi đơn.
- Xác định trình tự nucleotit thông qua trình tự amino axit dựa vào các bộ
ba mã hoá, tuy nhiên số mã của các amino axit thường có một số nucleotit trùng lặp hoặc một số bộ ba cùng quy định một loại amino axit, cho nên trình tự ADN thu được chỉ là tương đối.
- Xác định trực tiếp thông qua phản ứng kết thúc đầu cuối. Nguyên tắc chính là tạo ADN sợi đơn, mà phân tử sau có cùng trình tự và chỉ dài hơn phân tử trước một nucleotit ở một đầu cuối.
Gene ở tế bào tiền nhân có trình tự liên tục, còn gene ở sinh vật nhân thực có thể gián đoạn. Đoạn nucleotit mã hoá protein được gọi là exon, còn đoạn không mã hoá gọi là intron.
3.1. Phương pháp hoá học của Maxam-Gilbert
Nguyên tắc của phương pháp hoá học của Maxam-Gilbert là sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ (P32), xử lí hoá học để phá huỷ 1 nucleotit tạo ra hàng loạt các đoạn ADN có kích thước khác nhau.
Các đoạn DNA bị phá huỷ 1 nucleotit Điện di trên gel poliacrylamid
Hình 6.8. Sơđồ minh hoạ phương pháp Maxam-Gilbert Các khâu trong phương pháp Maxam-Gilbert :
(1). ADN sợi kép biến tính thành dạng sợi đơn. (2). Đánh dấu phóng xạ (P32) ởđầu 5'.
(3). Sử dụng 4 loại hoá chất khác nhau, mỗi loại hoá chất chỉ phá huỷ một loại nucleotit nhất định và tiến hành 4 phản ứng độc lập, kết qủa tạo ra các đoạn ADN kích thước khác nhau.
(4). Sản phẩm của 4 phản ứng được tiến hành điện di trên gel poliacrylamid. Trình tự nucleotit được đọc từ dưới lên theo chiều từ 5'→3'.
3.2. Phương pháp Sanger
Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng deoxynucleotit không có nhóm OH ở vị trí 3' do vậy trong quá trình kéo dài chuỗi polinucleotit enzyme polimerase gắn chúng vào chuỗi polinucleotit thì quá trình tổng hợp bị dừng lại. Kết quả tạo ra các đoạn ADN có kích thước hơn kém nhau một nucleotit, trên cơ
sởđó xác định được trình tự nucleotit.
Hình 6.9. Deoxynucleotit mất oxy ở vị trí C 3' của phân tửđường Các khâu của phương pháp Sanger:
(1) Biến tính ADN sợi kép thành ADN 2 sợi đơn. (2). Mồi tiếp hợp với ADN sợi đơn.
(3). Phản ứng tổng hợp chuỗi polinucleotit gồm: ADN sợi khuôn, primer, ADN polimerase và dNTP. Sự gắn dNTP mất nhóm OH ở vị trí 3' vào chuỗi polinucleotit làm quá trình tổng hợp bị dừng lại.
(4). Điện di trên gel poliacrylamid sẽ xác định được trình tự của đoạn ADN.
§4. RFLP TECHNOLOGY (Kĩ thuật phân tích hiện tượng đa hình của
độ dài các phân đoạn ADN)