Chương 8: TẾ BÀO CHỦ VÀ VECTOR
§2. VECTOR
Để thu nhận gene dưới dạng tinh sạch với hàm lượng lớn người ta phải tách dòng (clone) gene đó. Việc tách dòng cơ bản là tiến hành gắn trình tự ADN vào vector. Vector cũng là một ADN dạng vòng, có khả năng xâm nhập vào tế
bào vi khuẩn và mượn tế bào vi khuẩn để tạo ra những bản sao khác giống hệt vector ban đầu.
Hình 8.1. Sơđồ plasmid
Vector có các ứng dụng chủ yếu sau:
- Tạo dòng nhằm khuếch đại số lượng bản sao một trình tự ADN xác định. - Tạo sinh vật chuyển gene (chuyển các gene vào tế bào hay cơ thể).
- Sản xuất ARN với số lượng lớn từ ADN được tạo dòng. - Sản xuất protein với số lượng lớn từ ADN được tạo dòng.
- Vector có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào vật chủ. Độc lập với sự sao chép của bộ gene vật chủ.
- Vector có kích thước càng nhỏ càng tốt.
- Vector phải được phát hiện rõ ràng trong vật chủ. - Phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ.
- Vector chỉ tồn tại một vị trí nhận biết cho mỗi enzyme.
Vector được sử dụng trong kĩ thuật tách dòng phân tử ADN đối với tế bào
E. coli: (1) Plasmids; (2) Bacteriophage l, (3) Cosmids; (4) Bactenophage M13;
(5) Phagemids và một số loại vector đặc biệt khác như: (i) Ti plasmid; (ii) YACS; (iii) BACS; (iv) Retrovirus; (iiv) Baculovirus. (iiiv) Yeast 2 micron plasmid.
Việc lựa chọn sử dụng một loại vector dựa vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dòng và mục đích tạo dòng.
Vector được sử dụng với mục đích tách dòng gene (vector tách dòng) và chuyển gene (vector chuyển gene).
Hình 8.2. Plasmid pBR322 (a) và plasmid pUC18 (b)
(theo Nông Văn Hảí, 2002)
2.2. Các vector plasmid dùng cho E. coli
Có một số đặc điểm quan trọng mà các vectơ cần phải có, chúng phải những phân tử ADN nhỏ giúp cho việc phân tách và bảo quản chúng dễ dàng. Phải có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication), để cho ADN nó được nhân lên và do vậy được duy trì trong quần thể tế bào khi sinh vật chủ sinh trưởng và phân chia. Cần có một loại dấu chuẩn, chọn lọc (selectable marker) tạo điều kiện cho vector được dễ dàng phát hiện và cũng cần phải có ít nhất một
điểm cắt bởi enzyme giới hạn để tạo điều kiện cho ADN xen vào trong quá trình tạo ra các thể tái tổ hợp. Các plamid có các đặc điểm phù hợp với yêu cầu trên và chúng được sử dụng thường xuyên như các vector trong các thí nghiệm tách dòng.
Nhiều loại plasmid được tìm thấy trong tự nhiên ở các vi khuẩn và trong một số nấm men. Chúng là những phân tử AND mạch vòng tương đối nhỏ so với nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ. Các plasmid tồn tại chủ yếu ở trạng thái ngoài nhiễm sắc thể. Plasmid cos khả năng truyền các tính trạng cho vật chủ
(chẳng hạn: tính bền vững với kháng sinh), do vậy giúp cho việc lựa chọn dễ
dàng trong những điều kiện xác định. Các gene bền vững với kháng sinh do AND plasmid mã hóa thường được sử dụng trong việc thiết kế các vector dùng cho kĩ thuật di truyền vì chúng cung cấp một phương tiện thuận lợi để lựa chọn các tế bào có mang plasmid.
Các plasmid có thể phân chia thành 2 nhóm: tiếp hợp và không tiếp hợp. Các plasmid tiếp hợp có thể tự truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua quá trình tiếp hợp. Quá trình này đòi hỏi các chức năng của các đoạn đặc thù tra (transfer) và mob (mobilising) nằm trên plasmid. Các plasmid không tiếp hợp thì không tự truyền đi được. Một cách phân loại khác dựa trên số lượng các bản sao của plasmid có trong tế bào chủ. Các plasmid có số bản sao thấp có khuynh hướng kiểm soát chặt chẽ việc sao chép ADN, thường ADN plasmid loại này phải sao chép bắt buộc cùng với sự sao chép ADN nhiễm sắc thể của vật chủ. Các plasmid có số bản sao cao gọi lào các plasmid thoải mái, việc sao chép ADN của chúng không phụ thuộc vào sự sao chép ADN nhiễm sắc thể của tế
bào chủ. Nói chung, các plasmid tiếp hợp thường lớn, có cơ chế kiểm soát chặt chẽ việc sao chép ADN và tồn tại trong tế bào với số lượng bản sao thấp. Trong khi đó, các plasmid không tiếp hợp thường nhỏ, sao chép ADN một cách thoải mái và tồn tại trong tế bào với số bản sao cao.
2.2.2. Các plasmid cơ bản dùng để tách dòng
Trong kĩ thuật di truyền, các plasmid gặp trong tự nhiên thường được sửa
đổi nhiều để tạo ra các vector có đặc điểm mong muốn. Để đặt tên plasmid, chữ
p được dùng để chỉ plasmid và tiếp theo đó thường là tên của những người đã phân lập hoặc thiết kế plasmid. Các con số cũng có thể được sử dụng để phân loại các chủng cụ thể. Một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi là pBR322, nó được hoàn thiện bởi Francisco Bolivar và đồng nghiệp. Việc thiết kế pBR322 bao gồm một loạt những thao tác để có được những đoạn ADN cần thiết cùng nối với nhau với kết quả cuối cùng là một ADN có 3 nguồn gốc. Plasmid này có tất cả các đặc tính của một vector tốt, chẳng hạn như: trọng lượng phân tử thấp, có các gene kháng kháng sinh, có điểm khởi đầu sao chép, và có một số điểm cắt riêng biệt bởi các enzyme giới hạn.
Có một số plasmid trong nhóm pBR mang các đặc điểm khác nhau chút ít. Tuy nhiên, plasmid bắt nguồn từ pBR322 được sử dụng rộng rãi, vì chúng có
một số đặc điểm ưu việt so với plasmid ban đầu. Ví dụ: plasmid pAT153, là một dẫn xuất mất đoạn của pBR322. Plasmid này được tạo ra bằng các loại bỏ 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đoạn ADN từ pBR322 sau khi dùng enzym giới hạn Hael. Lượng ADN bị loại bỏ rất nhỏ (705 cặp bazơ), nhưng hiệu quả đã làm tăng số bản sao lên 3 lần và
đã loại bỏ các đoạn trình tự cần thiết cho quá trình huy động (mobilisation). Như
vậy, pAT153 về một số phương diện là vector "tốt hơn" pBR322, vì nó có nhiều bản sao hơn trong tế bào và nó có mức độ bền vững sinh học cao hơn do mất khả năng huy động.
Hình 8.3. Vector pBluescript (theo Nông Văn Hải, 2002)
Sự có mặt của 2 gene kháng kháng sinh (Apr và Tcr) cho phép lựa chọn các tế bào có mang plasmid, vì các tế bào đó sẽ kháng với cả ampicilin và tetracylin. Một ưu việt nữa là các điểm cắt giới hạn duy nhất nằm trong các gene kháng sinh cho phép lựa chọn được các ADN tách dòng, và do vậy được gọi là bất hoạt do xen đoạn (insertional inactivation), khi mà đoạn ADN xen vào làm gián đoạn đoạn mã hoá của gene kháng và vì vậy làm thay đổi kiểu hình của tế
bào mang ADN tái tổ hợp.
2.2.3. Các vectorplasmid khác
Mặc dù các plasmid pBR322 và pAT153 được sử dụng rộng rãi trong nhiều ứng dụng của tách dòng gene, còn có các vector plasmid khác cũng được sử dụng. Nói chung, chúng dược thiết kế sao cho có được những đặc tính cụ thể, không thấy có trong các vector đơn giản. Chúng có thể mang những khởi điểm
đặc hiệu để biểu hiện các gene xen vào hoặc chúng có thể có những ưu việt khác như tạo ra khả năng chọn lọc trực tiếp các thể tái tổ hợp. Một nhóm các vector plasmid cũng rất phổ biến là các plasmid thuộc họ PUC. Các plasmid này có
một đoạn ngắn chứa một số các điểm riêng lẻ bị cắt bởi enzyme giới hạn. Đoạn này gọi là đoạn đa liên kết (polilinker) hoặc điểm đa tách dòng (multiple cloning site), chúng rất hữu hiệu bởi vì có thể lựa chọn điểm cắt mong muốn để xen
đoạn ADN trong quá trình tạo ra ADN tái tổ hợp. Bản đồ của một trong các vector pUC có các điểm cắt giới hạn nằm trong vùng polilinker, các plasmid pUC còn có vùng mang gene - blaceosidaza, gene này mã hoá β α- peptit. Đoạn trình tự này có chứa vùng polilinker, và việc một đoạn ADN vào một trong những điểm tách dòng sẽ dẫn đến một α - peptit không hoạt động chức năng. Việc đó đặt cơ sở cho một phương pháp sàng lọc trực tiếp các thể tái tổ hợp rất hữu hiệu sử dụng cơ chất tạo màu X-gal. Mặc dù các vector plasmid có nhiều tính chất hữu hiệu và chúng rất quan trọng cho việc thao tác gene, nhưng chúng vẫn mang hàng loạt nhược điểm.
Hình 8.4. Tạo vector tái tổ hợp (theo Nông Văn Hải, 2002)
2.3. Các vector phage dùng cho E. coli
Mặc dù các vector dựa trên cơ sở phage về nhiều phương diện đặc hiệu hơn các vector plasmid, nhưng về thực chất chúng thực hiện cùng một chức năng, có nghĩa là chúng hoạt động như các phân tử mang các đoạn ADN. Có 2 loại phage(λ và M13) được hoàn thiện tích cực cho các mục đích tách dòng.
2.3.1. Phage
đã đặt nền móng cho sinh học phân tử hiện đại bằng cách nghiên cứu các phage
Đó là những "thể ăn khuẩn", và là các virut chỉ nhân lên được bên trong vi khuẩn. Vì chúng có kích thước rất nhỏ nên người ta còn gọi chúng là hạt (particle).
Về mặt cấu trúc, các phage chia thành 3 nhóm chính: (1) không đuôi;(2) có đầu và đuôi, và (3) có lông. Vật chất di truyền có thể là ADN mạch đơn, mạch kép, hoặc ARN. Thường thấy là các ADN mạch kép (DdsDN) (double- stranded ADN). Ở các phage không đuôi và có đuôi, hệ gene được bao bọc trong vỏ protein gọi là capsid (đôi khi được biết đến như vỏ hoặc đầu của phage. Trong các phage, dsADN điển hình hệ gene là những hệ gene bao gồm khoảng 50% toàn bộ khối lượng của hạt phage. Như vậy, phage là những hệ thống tương
đối đơn giản nếu so sánh với vi khuẩn, vì nguyên nhân này chúng được sử dụng rất rộng rãi như các mô hình để nghiên cứu sự biểu hiện của gene.
Hình 8.5. Hình ảnh phage λ
Các phage có thể phân thành phage độc (virulent) và phage ôn hoà (temperate), tuỳ thuộc vào chu trình sống của chúng. Khi một phage chui vào trong một tế bào vi khuẩn, nó có thể sinh ra nhiều phage và giết chết tế bào đó,
đó là chu trình sinh tan (litic) hoặc nó có thể nhập vào nhiễm sắc thể và ở lại đó mà không giết chết tế bào, đó là chu trình tiềm tan (lisogeneic). Phage độc là phage chỉ có chu trình sinh tan. Phage ôn hoà là phage có chu trình tiềm tan, nhưng cũng có thể có phản ứng sinh tan trong những điều kiện thích hợp.
Hệ gene của phage λ có chiều dài 48,5kb, mã hoá cho 46 gene. Toàn bộ
hệ gene đã được giải trình tự, và tất cả các điểm điều hoà đều đã được biết. Ở
hai đầu của hệ gene mạch dài có các đoạn ngắn (12bp) sợi đơn, chúng bổ trợ cho nhau. Các đoạn này là những "đầu dính", chúng tạo điều kiện cho hệ gene trở
thành mạch vòng sau khi nhiễm vào vi khuẩn. Đoạn của hệ gene được sinh ra bằng cách gắn các đầu dính gọi là điểm cos (cos site).
Hình 8.6. Hệ gene của Phage λ
Quá trình xâm nhiễm của phage vào vi khuẩn bắt đầu bằng việc phage bám vào dinh dưỡng điểm nhận trên bề mặt vi khuẩn. Khi phage bị hấp thụ thì ADN được tiêm vào bên trong tế bào và chu trình sống có thể bắt đầu. Hệ gene trở thành mạch vòng và phage bắt đầu chu trình sinh tan hoặc tiềm tan tuỳ thuộc vào một loại yếu tố như dinh dưỡng và trạng thái trao đổi chất của tế bào chủ và phụ thuộc vào tính đa nhiễm (số lượng phage xâm nhập vi khuẩn trong quá trình hấp thụ). Nếu chu trình tiềm tan bắt đầu thì hệ gene của phagenhập vào nhiễm sắc thể vật chủ và chúng được duy trì ở dạng prophage. Sau đó, nó sao chép cùng với ADN nhiễm sắc thể và được chuyển tới các tế bào thế hệ con trong một dạng ổn định. Nếu chu trình sinh tan bắt đầu thì một loạt các sự kiện phiên mã sẽ diễn ra, phage hoàn toàn làm chủ tế bào vật chủ và sinh ra nhiều bản sao của hệ gene phage cũng như các protein cấu trúc. Sau đó các thành phần này được lắp ráp lại hay còn gọi là bọc gói để tạo thành các phage trưởng thành, sau đó chúng thoát ra khỏi tế bào chủ khi tế bào này bị tan.
Để xác định số lượng các phage có trong dịch tan, người ta pha loãng nhiều lần dịch phage và trộn lẫn với một số lượng dư thừa vi khuẩn chỉ thị rồi cấy lên mặt thạch. Sau khi ủ, vi khuẩn sẽ mọc và tạo thành cái gọi là thảm vi khuẩn. Phage mọc trên thảm này sẽ làm cho các tế bào bị phage xâm nhiễm tiêu tan, tạo nên các vết tan (plaque) trên thảm. Sau đó, người ta đếm số lượng các vết tan và xác định được số lượng phage trong dịch huyền phù ban đầu. Vết tan có thể được lấy ra cho mọc và phân tích tiếp. Phage có thể nhân lên trong dịch lỏng bằng cách cho nhiễm giống đang mọc của tế bào chủ và ủ cho đến khi các tế bào bị tan hoàn toàn, số lượng các hạt phage sinh ra phụ thuộc vào độ đa nhiễm và vào trạng thái của chu trình sinh sản vi khuẩn mà chúng nhiễm vào.
Khi ADN chui vào tế bào thì nó chuyển sang phân tử mạch đôi gọi là dạng sao chép (RF) (replicative from), nó sao chép cho đến khi có khoảng 1000 bản sao trong tế bào. Tại thời điểm này, việc sao chép ADN trở nên bất đối xứng (asymmetric) và các bản sao mạch đơn của hệ gene được sinh ra và thoát khỏi tế (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bào như các hạt M13. Vi khuẩn không bị tan và vẫn còn sống trong suốt quá trình này, mặc dù quá trình sinh sản và phân chia có chậm hơn so với các tế bào không bị xâm nhiễm.
2.3.2. Các vector dựa trên cơs ở phage λ
Việc sử dụng phage λ làm vector tách dòng phụ thuộc vào một thực tế là không phải tất cả hệ gene của λ đều cần thiết cho phage hoạt động chức năng. Do vậy, có một phạm vi để đưa ADN ngoại lai vào, mặc dù một số đòi hỏi nhất
định cần phải có trong quá trình hoàn thiện các vector tách dòng dựa trên cơ sở
phage λ. Một là sự sắp xếp các gene trên hệ gene λ sẽ quyết định phần nào cần phải loại bỏ đi hoặc cần phải được thay thế để đưa ADN ngoại lai vào. Vùng trung tâm của hệ gene λ nằm giữa các vị trí 20 và 35 trên bản đồ, là một đoạn lớn có thể bỏ qua mà không cần có sự sắp xếp lại invitro một cách phức tạp đối với hệ gene. Vùng trung tâm này chủ yếu kiểm soát các tính chất tiềm tan của phage, và phần lớn vùng đó có thể cắt bỏ mà không làm suy yếu các chức năng cần thiết cho chu trình sinh tan. Hai là, phage λ kiểu dại nói chung có nhiều
điểm nhận biết của các enzyme giới hạn thường được sử dụng trong kĩ thuật tách dòng. Điều đó có thể là một khó khăn lớn, vì nó giới hạn sự lựa chọn các
điểm để xen ADN vào. Trong thực tế sẽ tương đối dễ dàng lựa chọn đối với phage có số lượng giới hạn các điểm bị cắt bởi các enzyme giới hạn cụ thể, và kĩ
thuật gây đột biến in vitro có thể được sử dụng để sửa đổi các điểm còn lại - tức các điểm không cần thiết. Như vậy, có thể nhận được phage mang tổ hợp mong muốn các điểm nhận biết bởi enzyme giới hạn.
Một trong các nhược điểm lớn của các vector λ là capsid chỉ có thể bọc gói một số lượng ADN nhất định trong quá trình lắp ráp phage, do vậy, nó giới hạn kích thước của các đoạn ADN ngoại lai cần tách dòng. Trong quá trình bọc gói, các hạt phage có khả năng sống có thể sinh ra với chiều dài ADN nằm trong khoảng 38kb đến 52kb.
2.3.3. Các vector dựa trên cơ sở phage M13
Có hai điểm trong việc gây nhiễm M13 có giá trị đối với kĩ thuật di truyền. Một là, dạng sao chép RF rất giống với plasmid, vì vậy có thể tách chiết và thao tác bằng cùng những kĩ thuật như nhau. Ưu điểm thứ hai là ADN sợi
đơn sinh ra trong quá trình nhiễm rất hữu ích trong các thí nghiệm như xác định trình tự theo phương pháp dùng dideoxynucleotit. Chỉ riêng về mặt này đã khiến