Máu đem li tâm 500 vòng/phút trên máy ly tâm Universad 320 (Đức) trong thời gian 10 phút thu huyết tƣơng giàu tiểu cầu (PRP), tiếp tục ly tâm phần máu còn lại với tốc độ 3000 vòng/phút trong thời gian 10 phút thu huyết tƣơng nghèo tiểu cầu (PPP).
- Dùng PPP để thay thế PRP trong các ống chứng. Mỗi dịch chiết thử phải làm song song trên hai ống PPP và PRP.
3.3.2.3. Tiến hành và kết quả
Mẫu thử: lấy chính xác 450µl PRP, thêm 50µl dịch chiết hạt Cần tây, cho vào cuvet của máy đo độ ngƣng tập tiểu cầu, ủ trong 10 phút ở 37độ C. Điều chỉnh giá trị độ ngƣng tập tiểu cầu về giá trị 0 trên máy đo. Thêm chất kích tập ADP 10µmol/l với thể tích là 5µl.
Đo độ ngƣng tập tiểu cầu trên máy đo Chronolog (Mỹ) tại Khoa huyết học - Bệnh viện Bạch Mai.
Mẫu chứng: Tiến hành tƣơng tự mẫu thử nhƣng dịch chiết hạt Cần tây đƣợc thay thế bằng 50µl dung dịch NaCl 0,9% , tiến hành song song trong cùng điều kiện với mẫu thử.
69
Mẫu chứng dƣơng: Tiến hành tƣơng tự mẫu thử nhƣng dịch chiết hạt Cần tây đƣợc thay thế bằng 50 µl dung dịch Aspirin 81 µg/ml, tiến hành song song trong cùng điều kiện với mẫu thử.
Mỗi mẫu chứng và thử đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần.
- Kết quả : Kết quả đánh giá ảnh hƣởng in vitro trên sự ngƣng tập tiểu cầu của dịch chiết hạt Cần tây đƣợc trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14: Kết quả đánh giá ảnh hƣởng in vitro của dịch chiết hạt Cần tây đối với sự ngƣng tập tiểu cầu
Mẫu Nồng độ dịch chiết (mg/ml) % ngƣng tập tiểu cầu pthử-chứng pthử-chứng dƣơng % Ức chế ngƣng tập tiểu cầu Thử 3,00 18,00 ± 1 <0,05 <0,05 72,44 ± 1,4 1,00 23,66 ± 4,33 <0,05 <0,05 63,78 ± 6,09 0,10 30,00 ± 1 <0,05 <0,05 54,08 ± 1,4 0,05 59,00 ± 1 <0,05 <0,05 9,23 ± 1,4 Chứng âm NaCl 0,9% 65,33 ± 2,33 <0,05 Chứng dƣơng Aspirin 81 µg/ml 37,00 ± 1 <0,05 47,88 ± 1,4
Ghi chú: n=3, kết quả biểu thị dưới dạng GTTB ± SD
Nhận xét: Dịch chiết ethanol hạt Cần tây có tác dụng ức chế sự ngƣng tập tiểu cầu rõ rệt và ổn định ở các nồng độ 0,05 mg/ml ; 0,10 mg/ml ; 1,00 mg/ml ; 3,00 mg/ml so với mẫu chứng và Aspirin ở nồng độ 81 µg/ml. Tác dụng của dịch chiết ở nồng độ 0,10 mg/ml tƣơng đƣơng với tác dụng của Aspirin ở 81 µg/ml.
Tác dụng ức chế ngƣng tập tiểu cầu của mẫu thử mạnh hơn mẫu chứng dƣơng có ý nghĩa thống kê ở các nồng độ dịch chiết 0,10 mg/ml, 1,00 mg/ml và 3,00 mg/ml (p<0,05).
70
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. VỀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU
Cần tây từ lâu đã đƣợc trồng và sử dụng phổ biến ở nƣớc ta nhƣ một loại rau ăn. Cây dễ sống, phát triển nhanh, phù hợp với nhiều nhiều điều kiện đất đai và khí hậu khác nhau nên cây đƣợc phân bố rộng rãi ở nhiều vùng trên cả nƣớc tạo nên nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá cả hợp lý.
4.2. VỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Dựa trên các tài liệu thu thập đƣợc cho thấy trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về cây Cần tây (Apium graveolens L.) với bộ phận sử dụng để làm thuốc là bộ phận trên mặt đất hoặc hạt Cần tây. Gần đây, các nghiên cứu trên thế giới đã bắt đầu chú trọng nhiều hơn tới hạt Cần tây và đã chứng minh bằng các mô hình thực nghiệm khoa học một số tác dụng sinh học quan trọng của hạt Cần tây nhƣ tác dụng hạ huyết áp [43], chống ung thƣ [39], chống loét dạ dày [52], chống viêm [36], kháng khuẩn [30], hạ acid uric huyết thanh [ ]. Do đó, hạt Cần tây có thể là một dƣợc liệu tiềm năng đóng góp vào việc phòng và điều trị những bệnh có tỷ lệ ngƣời mắc cao trong xã hội hiện đại nhƣ tăng huyết áp, viêm loét dạ dày và bệnh gút. Tuy nhiên, ở Việt Nam, số nghiên cứu về cây Cần tây còn chƣa nhiều và chủ yếu tập trung vào các bộ phận thân, lá. Cho đến nay mới chỉ có hai bài báo trong nƣớc đề cập đến thành phần hóa học của hạt Cần tây [7], [9]. Từ sự phân tích trên đây đã gợi ý cho nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài : Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng in vitro của cây Cần tây (Apium graveolens L.) mà đối tƣợng nghiên cứu chủ yếu là hạt Cần tây.
Dựa trên những tài liệu thu thập đƣợc, flavonoid và tinh dầu là hai nhóm chất có trong cây Cần tây đƣợc nghiên cứu nhiều hơn cả. Các flavonoid có trong cây Cần tây chủ yếu là dẫn chất của Apigenin và Luteolin. Apigenin (1)
71
dụng nổi bật là giãn mạch [42], ức chế men chuyển, chẹn kênh canxi [27], do đó giúp làm hạ huyết áp nhanh chóng, tác dụng chống viêm [29], chống ngƣng tập tiểu cầu [41], [53], do đó giúp làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch nhƣ đột quỵ, tai biến mạch máu não, huyết khối tĩnh mạch…Trong nhóm tinh dầu, 3n-Buthyl phthalid (3nB) (11) là hoạt chất đƣợc nghiên cứu khá đầy đủ với nhiều tác dụng quan trọng nhƣ hạ huyết áp [43], chống viêm [33], giải độc gan [22],… Đây cũng chính là thành phần tạo nên mùi thơm đặc trƣng của tinh dầu Cần tây. Do đó có thể kết luận flavonoid và tinh dầu là hai nhóm hoạt chất quan trọng có trong cây Cần tây.
4.3. VỀ THỰC VẬT
Mẫu cây Cần tây đƣợc thu hái tại Hải Hậu (Nam Định) đã đƣợc mô tả chi tiết về đặc điểm hình thái, cơ bản phù hợp với đặc điểm ghi trong tài liệu trong nƣớc [18], [12] và tài liệu nƣớc ngoài [56]. Dựa trên đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng khóa phân loại chi Apium L. và bản mô tả loài Apium graveolens L. của Thực vật chí Trung Quốc [56] để xác định tên khoa học cây Cần tây ở Nam Định là Apium graveolens L., họ Cần (Apiaceae).
Để xác định tên khoa học của cây Cần tây, chúng tôi dựa trên tài liệu thực vật chí Trung Quốc [39], tài liệu cây cỏ Việt Nam [12] là những tài liệu chuyên khảo về phân loại thực vật và đƣợc cập nhập đến năm 2010. Do đó, kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần khẳng định tên khoa học của cây Cần tây là Apium graveolens L. một cách thuyết phục và có cơ sở khoa học.
Quan sát đặc điểm bột của các bộ phận cây Cần tây dƣới kính hiển vi cho thấy đặc điểm giải phẫu điển hình của họ Cần (Apiaceae) có nhiều ống tiết tinh dầu. Điều này càng đƣợc khẳng định rõ hơn khi quan sát và mô tả đặc điểm vi phẫu hạt Cần tây thấy các ống tiết xếp đều đặn ở mỗi rãnh quả và ở giữa phần tiếp giáp 2 lá noãn.
72
Ở Việt Nam đã có khóa luận của tác giả Hoàng Tùng [18] nghiên cứu về đặc điểm vi phẫu lá, thân, rễ Cần tây. Trong đề tài này, chúng tôi mô tả đặc điểm bột lá, thân, rễ, hoa, quả Cần tây và vi phẫu quả Cần tây. Đây là đóng góp mới của đề tài mà không trùng lặp với những nghiên cứu trƣớc đây về Cần tây. Những kết quả nghiên cứu về đặc điểm vi học sẽ góp phần tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dƣợc liệu Cần tây.
4.4. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bằng phƣơng pháp cất kéo hơi nƣớc, hàm lƣợng tinh dầu của bộ phận trên mặt đất cây Cần tây đã đƣợc xác định là 0,19%. Trong khi đó, hàm lƣợng tinh dầu trong hạt Cần tây khá cao (2,52%). Phân tích tinh dầu BPTMĐ và tinh dầu hạt Cần tây bằng phƣơng pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS), kết quả xác định đƣợc 17 thành phần trong tinh dầu bộ phân trên mặt đất cây Cần tây và 12 thành phần trong tinh dầu hạt Cần tây. Trong đó, thành phần chính của tinh dầu BPTMĐ là myrcen (16,09%), limonen (46.23%). Thành phần chính của tinh dầu hạt Cần tây là β-selinen (49,37%). Đáng chú ý là hoạt chất 3nB đã có mặt trong cả tinh dầu BPTMĐ và tinh dầu hạt Cần tây. Kết quả nghiên cứu về thành phần của tinh dầu mẫu Cần tây Nam Định hoàn toàn phù hợp với những kết quả nghiên cứu trƣớc đây về thành phần tinh dầu Cần tây [9], [15]. Thành phần chính của tinh dầu BPTMĐ Cần tây là Limonen. Đây cũng chính thành phần đáng quan tâm bởi Limonen đã đƣợc chứng minh tác dụng chống ung thƣ, làm tan sỏi mật, chống trào ngƣợc dạ dày thực quản [63]... Để nhận dạng các thành phần của tinh dầu, chúng tôi đã phân tích và đối chiếu với các thƣ viện phổ khối NIST 08, FLAVOR 2 và WILEY W9N08. Chúng tôi nhận thấy thƣ viện phổ WILEY có số chất nhiều hơn với thƣ viện phổ NIST 08 và FLAVOR 2 đặc biệt là các hợp chất dễ bay hơi (tinh dầu). Do đó, thƣ viện phổ WILEY W9N08 là thƣ viện phổ thích hợp để nghiên cứu xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng phƣơng pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS).
73
Phƣơng pháp phân tích tinh dầu đã thiết lập mới chỉ là khảo sát bƣớc đầu, cần khảo sát thêm nhiều phƣơng pháp phân tích khác để có thể lựa chọn đƣợc phƣơng pháp phân tích tối ƣu cho tinh dầu Cần tây bằng GC/MS.
Định tính các nhóm chất chính bằng các phản ứng hóa học cho thấy BPTMĐ Cần tây có Alcaloid, Flavonoid, Saponin, Coumarin, Tanin, Acid amin, đƣờng khử, Sterol và Caroten. Hạt Cần tây có chứa Flavonoid, Saponin, Coumarin, Tanin, đƣờng khử, chất béo, Caroten. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây về thành phần hóa học của BPTMĐ cũng nhƣ hạt Cần tây trên thế giới [67], [61] và ở Việt Nam [18]. Trong đó, flavonoid là thành phần hóa học chính của cả BPTMĐ và hạt Cần tây.
Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng một lần nữa khẳng định flavonoid có là thành phần chính của dịch chiết BPTMĐ cũng nhƣ của dịch chiết hạt Cần tây. Hơn nữa, đây cũng chính là một trong hai nhóm hoạt chất quan trọng của cây Cần tây với nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về nhóm flavonoid trong hạt Cần tây.
Kết quả xác định lƣợng chất chiết đƣợc bằng ethanol cho thấy cả BPTMĐ và hạt Cần tây đều có các chất tan trong ethanol với hàm lƣợng lớn (BPTMĐ: 9,38%, hạt: 11,10%). Mặt khác, cả flavonoid và tinh dầu đều tan hoàn toàn trong ethanol TĐ, cho nên có thể dự đoán dịch chiết ethanol BPTMĐ và hạt Cần tây có chứa các hoạt chất với hàm lƣợng cao. Vì vậy, các nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học đƣợc tiến hành với dịch chiết ethanol TĐ hạt Cần tây.
Trong quá trình chiết xuất dịch chiết cồn hạt Cần tây, phân đoạn tủa DC2 đƣợc tách ra với một khối lƣợng lớn. Định tính phân đoạn này bằng phản ứng hóa học cho kết quả dƣơng tính rất rõ với các phản ứng định tính flavonoid, âm tính với các phản ứng định tính coumarin, tannin, và chất béo, cho nên có thể kết luận sơ bộ rằng phân đoạn dịch chiết DC2 có thành phần chủ yếu là flavonoid.
74
Định tính phân đoạn DC2 bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, kết quả cho thấy các hệ dung môi có độ phân cực cao và có chứa Toluen, Ethyl acetat, acid formic thì vết chất tách nhau khá rõ. Dịch chiết PĐ CT của hạt Cần tây khi khai triển SKLM với hệ dung môi VIII là tốt nhất, cho 18 vết, trong đó vết 1, 4, 5, 7, 9, 11, 13 hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 365 nm mạnh nhất nên dự đoán các vết này có thể là flavonoid. Điều này lại một lần nữa khẳng định phân đoạn DC2 là phân đoạn dịch chiết giàu flavonoid. Do đó, chúng tôi tiến hành phân lập flavonoid trong phân đoạn dịch chiết DC2.
Kết quả, bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion và sắc ký cột hấp phụ đã phân lập đƣợc 1 chất tinh khiết ký hiệu là CT3 từ phân đoạn dịch chiết DC2. Định tính CT3 bằng phản ứng hóa học và bằng SKLM cho thấy CT3 là hợp chất thuộc nhóm flavonoid. Căn cứ vào các dữ liệu phổ MS và NMR, CT3 đã đƣợc nhận dạng là Luteolin - một flavonoid có khung cơ bản là flavon,. Đây là lần đầu tiên Luteolin đƣợc phân lập từ hạt Cần tây ở Việt Nam. Vì vậy, kết quả này là một đóng góp mới của đề tài. Trong tự nhiên, ngoài Cần tây, Luteolin còn có trong thành phần của lá Actisô, hoa Kim ngân, Hành, Tỏi, một số loại cải bắp, cà rốt,…[51]. Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy Luteolin đƣợc chứng minh có tác dụng chống oxy hóa [38], chống viêm [45], chống dị ứng [49], chống ung thƣ [34], phòng bệnh thận do đái tháo đƣờng [44]… Việc phân lập đƣợc Luteolin từ hạt Cần tây cũng là cơ sở để sử dụng chất này làm chất đối chiếu phục vụ cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dƣợc liệu hạt Cần tây.
4.5. VỀ TÁC DỤNG IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT HẠT CẦN TÂY
Hiện nay, những bệnh lý về huyết khối là một trong ba nhóm bệnh có số bệnh nhân tử vong cao nhất thế giới. Bệnh huyết khối đƣợc chia làm hai thể chính là huyết khối động mạch và huyết khối tĩnh mạch. Trong đó, huyết khối động mạch là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến đột quỵ cũng nhƣ tắc mạch não,
75
gây ra những hậu quả rất nghiêm trọng về sức khỏe và có thể dẫn tới tử vong. Đối với huyết khối tĩnh mạch thƣờng gặp là thuyên tắc tĩnh mạch chi hoặc phổi, cũng là một trong những nhóm bệnh có tỉ lệ cao trong cộng đồng, gây ảnh hƣởng đến chất lƣợng cuộc sống của con ngƣời [60].
Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy rằng quá trình đông máu và sự ngƣng tập tiểu cầu có vai trò vô cùng quan trọng trong việc hình thành huyết khối [60]. Vì vậy, thuốc điều trị huyết khối hiện nay gồm hai nhóm chính là các thuốc chống đông và các thuốc ức chế ngƣng tập tiểu cầu. Trong đó, các thuốc chống đông máu thƣờng dùng là Heparin và Warfarin, thuốc chống ngƣng tập tiểu cầu phổ biến nhất là Aspirin. Tuy nhiên, các thuốc này vẫn còn nhiều tác dụng không mong muốn gây hạn chế trong điều trị huyết khối. Chẳng hạn nhƣ Heparin và Warfarin khi dùng trong thời gian dài sẽ làm tăng nguy cơ chảy máu [60]. Hơn nữa, một số tài liệu cho thấy tác dụng của hai thuốc trên rất khó kiểm soát. Aspirin có thể gây thiếu máu cục bộ cho bệnh nhân [60]. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm những thuốc mới để phòng và điều trị huyết khối, đặc biệt các thuốc có nguồn gốc tự nhiên rất đƣợc quan tâm.
Thực nghiệm khoa học đã chứng minh Apigenin - một thành phần flavonoid có trong hạt Cần tây có tác dụng rõ ràng trong việc ức chế ngƣng tập tiểu cầu [67]. Điều đó đã gợi mở ra một giả thiết rằng liệu hạt Cần tây có chứa Apigenin thì có tác dụng ức chế sự ngƣng tập tiểu cầu hoặc xa hơn nữa có tác dụng ức chế sự hình thành huyết khối hay không? Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thăm dò sự ảnh hƣởng in vitro của dịch chiết hạt Cần tây đối với quá trình đông máu và sự ngƣng tập tiểu cầu. Hơn nữa, mô hình thí nghiệm in vitro khá đơn giản, dễ thực hiện và học viên có thể tự mình tiến hành. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn hai mô hình thực nghiệm in vitro để đánh giá tác dụng của dịch chiết hạt Cần tây trên hệ đông máu cơ bản và trên sự ngƣng tập tiểu cầu nhƣ đã mô tả ở mục 2.2.3.
76
Đây là lần đầu tiên trên thế giới và ở Việt Nam công bố về kết quả đánh giá sự ảnh hƣởng in vitro của dịch chiết hạt Cần tây đối với hệ đông máu và tác dụng dụng ức chế ngƣng tập tiểu cầu và đồng thời cũng là đóng góp mới của đề tài.
Kết quả nghiên cứu của đề tài bƣớc đầu cho thấy dịch chiết hạt Cần tây thể hiện tác dụng ức chế sự ngƣng tập tiểu cầu in vitro tốt và ổn định ở nồng độ thấp (0,1mg/ml) so với Aspirin 81 µg/ml. Mặt khác, các thuốc ức chế ngƣng tập tiểu cầu đóng vai trò quan trọng trong việc phòng và điều trị các