Sử dụng phƣơng pháp sắc ký cột pha thƣờng với chất hấp phụ là Silicagel có cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (MERCK).
* Chuẩn bị cột
- Cột sắc ký kích thƣớc 1,5 x 50cm đƣợc lắp thẳng đứng trên giá, tráng sạch bằng cồn. Vặn khóa cột. Lót một lớp bông sạch dày khoảng 1cm ở đáy cột, lót một miếng giấy lọc sạch bằng đƣờng kính cột trên lớp bông. Nhồi cột sao cho chiều cao cột silicagel khoảng 10cm.
- Sử dụng hệ dung môi rửa giải Dichloromethan/Methanol/Nƣớc (7 : 1 : 0.1) để cột ổn định trong 2-3 giờ.
- Lót miếng giấy lọc bằng đƣờng kính cột lên trên bề mặt chất nhồi cột. * Chuẩn bị dịch chiết để đƣa lên cột
- Lấy khoảng cắn phân đoạn F1 hòa tan hoàn toàn trong lƣợng tối thiểu pha động.
- Mở khóa cột để dung môi chảy từ từ đến khi lớp dung môi trong cột gần sát bề mặt lớp silicagel.
58
- Dùng pipet để đƣa từ từ dịch cắn F1 hòa tan trong pha động lên cột sao cho chiều cao lớp dịch chiết khoảng 1cm, tránh xáo trộn cột.
- Mở khóa cột cho tới khi dịch chiết nƣớc ngấm xuống hết lớp silicagel thì cho một ít pha động vào để rửa sạch dịch chiết bám trên thành cột. Đợi đến khi dung môi trong cột gần sát lớp bề mặt silicagel thì bổ sung thêm dung môi một cách nhẹ nhàng, tránh xáo trộn.
* Rửa giải
- Rửa giải cột với hệ dung môi Dichloromethan/Methanol/Nƣớc (7:1:0.1) - Điều chỉnh khóa cột sao cho tốc độ rửa giải khoảng 1 giọt/giây.
- Hứng dịch rửa vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống hứng khoảng 5ml dịch rửa giải. Để các ống nghiệm bay hơi tự nhiên.
- Kiểm tra dịch rửa giải ở các ống bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi : Chloroform : Ethanol : Nƣớc (4 : 2 : 0,5; lớp dƣới). Quan sát vết dƣới ánh sáng thƣờng, UV 254nm và UV 366nm, hiện màu bằng hơi NH3 đặc.
Gộp các ống có cùng số vết trên sắc ký đồ.
* Kết quả thu đƣợc 4 phân đoạn kí hiệu là F1A, F1B, F1C, F1D. Tiếp tục tiến hành phân lập lần 3 từ phân đoạn F1C.