Tiến hành phân lập chất từ PĐ2.
Sử dụng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion với chất nhồi cột là Dianion HP20.
* Chuẩn bị cột
Cột sắc ký kích thƣớc 3,5 x 50cm đƣợc lắp thẳng đứng trên giá, tráng sạch bằng cồn. Vặn khóa cột. Lót một lớp bông sạch dày khoảng 1cm ở đáy cột, lót một miếng giấy lọc sạch bằng đƣờng kính cột trên lớp bông. Đƣa từ từ Dianion HP20 ngâm trong methanol vào cột. Để cột ổn định trong 2-3 giờ bằng nƣớc. Lót miếng giấy lọc bằng đƣờng kính cột lên trên bề mặt chất nhồi cột.
* Chuẩn bị dịch chiết để đưa lên cột
- Hòa tan 3g tủa PĐ2 trong lƣợng tối thiểu nƣớc, đun nóng nhẹ.
- Mở khóa cột để dung môi chảy từ từ đến khi lớp dung môi trong cột gần sát bề mặt lớp Dianion.
- Dùng pipet để đƣa từ từ dịch PĐ2 hòa tan trong nƣớc lên cột sao cho chiều cao lớp dịch chiết khoảng 1cm, tránh xáo trộn cột.
- Mở khóa cột cho tới khi dịch chiết nƣớc ngấm xuống hết lớp Dianion, rửa sạch dịch chiết bám trên thành cột bằng nƣớc. Đợi đến khi dung môi trong cột gần sát lớp bề mặt Dianion thì bổ sung thêm nƣớc một cách nhẹ nhàng, tránh xáo trộn.
* Rửa giải
- Rửa giải cột bằng methanol trong nƣớc gradient từ 0% tới 100%. - Điều chỉnh tốc độ rửa giải khoảng 1 giọt/giây.
- Hứng dịch rửa giải vào các cốc có mỏ, mỗi cốc hứng khoảng 50ml dịch rửa giải.
- Kiểm tra dịch rửa giải ở các cốc bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi: Chloroform : Ethanol : Nƣớc (4 : 2 : 0,5; lớp dƣới). Quan sát vết dƣới
57
ánh sáng thƣờng, UV 254nm và UV 366nm, hiện màu bằng hơi NH3 đặc. Gộp các cốc có cùng số vết trên sắc ký đồ thành 1 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm cho tới cắn.
* Kết quả
Thu đƣợc 3 phân đoạn kí hiệu F1, F2, F3.
- F1 thu đƣợc khi rửa giải bằng dung môi chứa 25% methanol, có khối lƣợng 850mg
- F2 thu đƣợc khi rửa giải bằng dung môi chứa 50% methanol có khối lƣợng 2,5g
- F3 thu đƣợc khi rửa giải bằng dung môi chứa 100% methanol có khối lƣợng 1,5g
Tiếp tục tiến hành phân lập lần 2 với phân đoạn F1.