2.2.3.1. Chuẩn bị dịch chiết
- Hạt Cần tây khô đƣợc xay thành bột thô bằng máy xay và xác định độ ẩm bằng máy Precisa thu đƣợc kết quả độ ẩm của dƣợc liệu là 8,5%.
- Cân chính xác 50,0000 g bột dƣợc liệu cho vào cốc có mỏ. Chiết dƣợc liệu bằng ethanol theo phƣơng pháp chiết nóng. Gộp dịch chiết, đem cô cách thủy ở 700 đến cắn.
- Chuẩn bị dịch chiết thử tác dụng bắt đầu từ nồng độ 10mg/ml với dung môi hòa tan cắn là nƣớc cất với mô hình đánh giá ảnh hƣởng trên hệ
26
đông máu in vitro và dung dịch NaCl 0,9% với mô hình đánh giá ảnh hƣởng trên sự ngƣng tập tiểu cầu in vitro.
- Từ dung dịch trên pha loãng với nƣớc cất thành các nồng độ thích hợp thử tác dụng in vitro.
Bảng 2.1: Thành phần các mẫu trong thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết hạt Cần tây đối với hệ đông máu
2.2.3.2. Đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết Cần tây đối với hệ đông máu
in vitro
- Tiến hành theo phƣơng pháp của tác giả Caroline Manicam mô tả trong tài liệu [28] với một số thay đổi phù hợp với điều kiện thí nghiệm.
- Chuẩn bị dịch chiết đem thử : Dịch chiết Cần tây đƣợc chuẩn bị theo quy trình mô tả ở mục 2.2.3.1.
- Đánh giá ảnh hƣởng trên hệ đông máu của dịch chiết Cần tây dựa trên một số thông số: thời gian Prothrombin (Thời gian Quick) (PT); thời gian Thromboplastin (Thời gian Cephalin – Kaolin) (ATTP) ; Thời gian Thrombin (TT)
Thành phần Xét nghiệm các chỉ số đông máu
PT APTT TT
Huyết tƣơng 50µl 50µl 50µl
Mẫu thử : dịch chiết dƣợc liệu
Mẫu chứng : Nƣớc cất
Chứng dương: dd Heparin 0,5IU/ml
50µl 50µl 50µl
Thromboplastin 50µl 0 0
Cephalin-kaolin 0 50µl 0
Dd CaCl2 0.025M 0 50µl 0
Thrombin 0 0 50µl
27
Lấy máu của 1 ngƣời tình nguyện khỏe mạnh vào buổi sáng cho vào ống nghiệm có vạch định mức 2ml đã có sẵn chất chống đông Natri citrat 3,8% với tỷ lệ 9 thể tích máu: 1 thể tích chống đông, trộn đều.
Mẫu thử: Nhỏ vào ống nghiệm máu đã đƣợc tiến hành chống đông nhƣ trên dịch chiết Cần tây ở nồng độ thích hợp.
Mẫu chứng : Nhỏ vào ống nghiệm máu đã đƣợc tiến hành chống đông nhƣ trên thay dịch chiết dƣợc liệu bằng nƣớc cất, trộn đều.
Mẫu chứng dƣơng : Nhỏ vào ống nghiệm máu đã đƣợc tiến hành chống đông nhƣ trên thay dịch chiết dƣợc liệu bằng dung dịch Heparin 0,5 IU/ml, trộn đều.
Ly tâm mẫu chứng và mẫu thử. Dịch sau khi ly tâm đƣợc đem đo thời gian Prothrombin (PT); thời gian Thromboplastin (ATTP) ; thời gian Thrombin (TT) trên máy CA-1500 tại Phòng Đông máu, Khoa Huyết học truyền máu – Bệnh viện Bạch Mai. So sánh kết quả giữa mẫu thử và mẫu chứng.
2.2.3.3. Đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết Cần tây đối với sự ngƣng tập
tiểu cầuin vitro
Theo dõi sự ngƣng tập tiểu cầu trong huyết tƣơng theo phƣơng pháp của Born (1963) ghi trong tài liệu Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo [19] bằng máy đo độ kết tập tiểu cầu tự động tại Phòng Đông máu, Khoa Huyết học truyền máu – Bệnh viện Bạch Mai.
- Chuẩn bị dịch chiết đem thử : Dịch chiết Cần tây đƣợc chiết theo quy trình mô tả ở mục 2.2.3.1.
- Đánh giá ảnh hƣởng trên sự ngƣng tập tiểu cầu của dịch chiết Cần tây Mẫu thử : Cho dịch chiết Cần tây ở nồng độ thích hợp vào huyết tƣơng giầu tiểu cầu cùng với chất kích thích ngƣng tập tiểu cầu Adenin diphosphat (ADP), ủ ở 37oC trong 10 phút trên máy đo ngƣng tập tiểu cầu.
28
Mẫu chứng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ mẫu thử nhƣng thay dịch chiết Cần tây bằng dung dịch NaCl 0,9%..
Mẫu chứng dƣơng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ mẫu thử nhƣng thay dịch chiết Cần tây bằng dung dịch Aspirin % pha trong dung dịch NaCl 0,9%.
Đánh giá tác dụng ức chế ngƣng tập tiểu cầu của mẫu thử bằng cách so sánh độ kết tập tiểu cầu giữa mẫu thử và mẫu chứng.
Độ ức chế ngƣng tập tiểu cầu đƣợc tính theo công thức : (% Độ ngƣng tập của chứng - % Độ ngƣng tập của thử)
% Ức chế = ×100
% Độ ngƣng tập của mẫu chứng
