M Ở ĐẦU
3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Kích thước nguyên liệu là một trong những yếu quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly các chất trong nấm Linh Chi. Bình thường các hợp chất được giữ
trong tế bào, chúng rất khó được tách ra nếu không có các tác động của yếu tố bên ngoài. Việc nghiền nhỏ nguyên liệu có tác dụng làm cho tế bào bị phá vỡ, từđó giải phóng ra các chất. Tạo điều kiện cho quá trình trích ly dễ dàng và triệt để hơn.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nguyên liệu tới việc trích ly hoạt chất triterpenoid trong nấm Linh Chi được tiến hành như trong phần 3.4.2.1a. Kết quả
thu được như bảng và đồ thị sau:
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi ( mm)
Kích thước (mm) d≤2 2<d≤5 2<d≤10 d>10
Hàm lượng triterpenoid 3,64a 2,84b 2,03c 1,58d
(Chú thích: a, b, c, d: sai khác giữa các công thức xử lý trong cùng một thời điểm có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 5%)
Hình 4.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu quả trích ly triterpenoid
Qua bảng trên ta thấy: Các kích thước nguyên liệu khác nhau sẽ cho giá trị
triterpenoid khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%. Nguyên liệu càng mịn thì sẽ
tách được các hoạt chất triệt để hơn.
Nguyên liệu ở kích thước d ≤ 2 cho giá trị triterpenoid cao nhất với lượng triterpenoid là 3,64 mg/g. Tiếp đến là ở kích thước 2 < d ≤ 5 cho hiệu suất đứng thứ
2 với lượng triterpenoid là 2,84 mg/g. Nguyên liệu ở kích thước 5 < d ≤ 10 cho hiệu suất đứng thứ 3 với lượng triterpenoid là 2,03 mg/g. Nguyên liệu ở kích thước d > 10 chỉ cho lượng triterpenoid là 1,58 mg/g thấp hơn 2,06 mg/g so với kích thước nguyên liệu ở d ≤ 2. Điều này chứng tỏ, nguyên liệu có kích thước càng lớn thì càng làm giảm lượng hoạt chất được chiết ra. Tuy nhiên không nên nghiền nguyên liệu quá nhỏ, vì nó sẽ ảnh hưởng đến quá trình lọc, gây tốn năng lượng và công sức.Từ
những lập luận đó, chúng tôi lựa chọn kích thước nấm Linh Chi thích hợp nhất là ở
kích thước d ≤ 2 và sử dụng kết quả này cho các nghiên cứu sau.
4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
4.2.1. Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Việc sử dụng loại dung môi nào cho trích ly là rất quan trọng , vì dung môi
để hoà tan các chất cần trích ly và hạn chế hòa tan các tạp chất, do đó dung môi có ảnh hưởng lớn tới chất lượng của dịch chiết và thành phẩm.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của dung môi tới việc trích ly hoạt chất triterpenoid trong nấm Linh Chi được tiến hành như trong phần 3.4.2.2.a. Kết quả
thu được như bảng và đồ thị sau:
Bảng 4.2.1. Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi (ml)
Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi
Ethyl acetate Ethanol Methanol
Hàm lượng
triterpenoid 2,76
b
3,64a 3,68a
(Chú thích: a, b, c, d: sai khác giữa các công thức xử lý trong cùng một thời điểm có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 5%)
Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Qua bảng trên ta thấy: Các dung môi khác nhau sẽ cho giá trị triterpenoid khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%.
Nguyên liệu được trích ly bằng dung môi methanol cho giá trị triterpenoid cao nhất với lượng triterpenoid là 3,68 mg/g. Tiếp đến là dung môi ethanol cho hiệu suất đứng thứ 2 với lượng triterpenoid là 3,64 mg/g. Dung môi ethyl actate cho hiệu suất thấp nhất với lượng triterpenoid là 2,76 mg/g thấp hơn 0,92 mg/g so với trích ly bằng methanol đó là do dung môi ethyl acetate là dung môi có tính phân cực nhẹ
nên cho hiệu quả trích ly thấp nhất.
Khi sử dụng methanol làm dung môi trích ly sẽ gây tốn kém về kinh tế cũng như tính an toàn đối với chế phẩm thu được sau trích ly, thay vì sử dụng dung môi trích ly là methanol ta sẽ sử dụng dung môi là ethanol bởi độ an toàn cao hơn, giá thành rẻ hơn và cho hiệu suất trích ly cũng không kém gì methanol.
Từ những lập luận đó, chúng tôi lựa chọn dung môi trích ly tối ưu nhất là ethanol và sử dụng kết quả này cho các nghiên cứu sau.
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi trong nấm Linh Chi
Ethanol là dung môi có khả năng hòa tan các hoạt chất sinh học khá tốt. Sử dụng ethanol ở các nồng độ khác nhau sẽ có hiệu quả của quá trình trích ly khác nhau.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol tới việc trích ly hoạt chất triterpenoid trong nấm Linh Chi được tiến hành như trong phần 3.4.2.2.b. Kết quả thu được như bảng và đồ thị sau:
Bảng 4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi (%)
Nồng độ ethanol 80 85 90 95
Hàm lượng
triterpenoid 2,7
c 3,04b 3,64a 3,69a
(Chú thích: a, b, c, d: sai khác giữa các công thức xử lý trong cùng một thời điểm có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 5%)
Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Qua bảng trên ta thấy: Các dung môi khác nhau sẽ cho giá trị triterpenoid khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%.
Nguyên liệu được trích ly bằng dung môi ethanol ở nồng độ 95% cho giá trị
triterpenoid cao nhất với lượng triterpenoid là 3,69 mg/g. Tiếp đến là dung môi ethanol nồng độ 90% cho hiệu suất đứng thứ 2 với lượng triterpenoid là 3,64 mg/g.
Dung môi ethanol ở nồng độ 85% cho hiệu suất đứng thứ 3 với lượng triterpenoid là 3,04 mg/g. Với dung môi ethanol ở nồng độ 80% chỉ cho lượng triterpenoid là 2,7 mg/g thấp hơn 0,99 mg/g so với trích ly bằng ethanol ở nồng độ 95% đó là do khi trích ly bằng ethanol 80% hàm lượng nước có trong dung môi cao hơn đối với hàm lượng nước trong ethanol 95% mà triterpenoid không tan trong nước.
Tuy nhiên khi sử dụng ethanol 95% làm dung môi trích ly sẽ gây tốn kém về
kinh tế và hàm lượng triterpenoid khi trích ly ethanol ở nồng độ 95% cũng không chênh lệch nhiều so với sử dụng ethanol ở nồng độ 90%.
Từ những lập luận đó, chúng tôi lựa chọn nồng độ dung môi ethanol trích ly tối ưu nhất là ethanol 95% và sử dụng kết quả này cho các nghiên cứu sau.
4.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi trong nấm Linh Chi
Lượng dung môi nhiều hay ít đều ảnh hưởng tới quá trình các chất trong nguyên liệu. Nếu lượng dung môi quá ít thì chỉ đủ để thấm ướt nguyên liệu vì vậy hiệu suất trích ly sẽ thấp. Ngược lại, nếu lượng dung môi sử dụng quá nhiều thì gây hao phí dung môi, nhiên liệu trong quá trình lọc cô và các chi phí khác. Vì vậy việc tìm ra tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là rất cần thiết cho quá trình trích ly, thu sản phẩm.
Tiến hành thí nghiệm theo các bước trong phần 3.4.2.2.c Chúng tôi thu được các kết quả sau:
Bảng 4.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi (mg/ml)
Tỉ lệ nguyên
liệu/dung môi 1/20 1/25 1/30 1/35 1/40
Hàm lượng
triterpenoid 3,73
d 3,80c 4,03b 4,37a 4,37a
(Chú thích: a, b, c: sai khác giữa các công thức xử lý trong cùng một thời điểm có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 5%)
Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Bảng kết quả trên cho thấy: ở các tỷ lệ dung môi khác nhau cho tỷ lệ hoạt chất chiết khác nhau ở mức ý nghĩa 5%. Nguyên liệu được trích ly bằng dung môi methanol với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/40 cho giá trị triterpenoid cao nhất với lượng triterpenoid là 4,40 mg/g. Tiếp đến là tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/35 cho hiệu suất đứng thứ 2 với lượng triterpenoid là 3,73 mg/g. Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/30 cho hiệu suất đứng thứ 3 với lượng triterpenoid là 4,03 mg/g. Với tỷ lệ
ngyên liệu/dung môi là 1/25 và 1/20 chỉ cho lượng triterpenoid lần lượt là 3,80 mg/g và 3,73 mg/g hàm lượng triterpenoid giảm dần. Tuy nhiên khi sử dụng tỷ lệ
nguyên liệu/dung môi là 1/40 sẽ gây tốn kém về kinh tế và sẽ gây khó khăn cho quá trình lọc về sau mà hàm lượng triterpenoid thu đươc không thay đổi bởi hàm lượng triterpenoiid trong nguyên liệu đã được trích ly hoàn toàn với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/35.
Để đảm bảo hiệu suất trích ly cũng như tối thiểu các chi phí (nguyên liệu, năng lượng…) chúng tôi lựa chọn ở tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/35 làm kết quả cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi Linh Chi
Nhiệt độ là một trong yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới quá trình trích ly. Khi nhiệt độ trích ly càng cao sẽ làm cho độ xốp của nguyên liệu tăng lên (do nguyên liệu trương nở), độ nhớt giảm và hoạt chất sẽ hòa tan dễ hơn vào dung môi. Tuy
nhiên nhiệt độ là một yếu tố có giới hạn vì nhiệt độ quá cao có thể xảy ra các phản
ứng khác không cần thiết như tăng độ tan của một số tạp chất, khó khăn cho quá trình lọc, thúc đẩy các biến đổi hóa học làm chất lượng dịch chiết biến đổi không có lợi và làm tăng chi phí sản xuất. Do đó chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát ở nhiệt
đô 60oC, 70oC, 80oC, 90oC và 100oC. Kết quả thu được theo bảng và đồ thị sau:
Bảng 4.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi (o
C)
Nhiệt độ 70 80 90 100
Hàm lượng
triterpenoid 4,37
b 4,65a 4,66a 4,67a
(Chú thích: a, b, c, d: sai khác giữa các công thức xử lý trong cùng một thời điểm có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 5%)
Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Theo bảng trên: Khi nhiệt độ tăng thì giá trị triterpenoid tăng lên tỷ lệ với độ
cao của nhiệt độ. Ở nhiệt độ 70oC cho lượng tritrepenoid là 4,37 mg/g, sau đó khi nhiệt độ tăng lên 80oC thì lượng triterpenoid là 4,65 mg/g. Ở nhiệt 90oC và 100oC thì lượng triterpenoid lần lượt là 4,66 mg/g và 4,67 mg/g. Có thể thấy rõ là khi tăng nhiệt độ hàm lượng triterpenoid tăng không nhiều, bởi ethanol có nhiệt độ sôi là 78oC khi nhiệt độ lên đến 80oC là khi đó triterpenoid đã được trích ly rồi, càng tăng nhiệt độ lên thì hàm lượng triterpenoid sẽ tăng nhưng không cao hơn nhiều.
Vậy để tiết kiệm chí phí năng lượng, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 80oC là nhiệt độ thích hợp cho trích ly các hoạt chất trong nấm Linh Chi và sử dụng nhiệt
độ này cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.5. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi Chi
Thời gian trích ly có ảnh hưởng mạnh mẽ tới hiệu quả trích ly và chi phí năng lượng cũng như dung môi. Nếu thời gian trích ly ngắn, thì các hoạt chất giải phóng ra ít, nhưng khi tăng thời gian trích ly thì làm tổn hao năng lượng, quá trình sản xuất kéo dài. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ở các mức thời gian sau 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút ở cùng điều kiện.
Kết quả thí nghiệm thu được trình bày theo bảng và đồ thị dưới đây:
Bảng 4.2.5. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến đến hiệu suất trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi (phút)
Thời gian 30 60 90 120 150
Hàm lượng
triterpenoid 2,73
d 3,35c 4,65b 4,73a 4,75a
(Chú thích: a, b, c, d: sai khác giữa các công thức xử lý trong cùng một thời điểm có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 5%)
Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Qua bảng số liệu trên chúng tôi nhận thấy: thời gian trích ly càng dài thì càng trích ly kiệt hoạt chất có trong nguyên liệu. Tuy nhiên, đến một thời gian trích ly nhất định thì lượng hoạt chất tăng lên rất chậm hoặc không tăng nữa. Khi trích ly ở
thời gian 30 phút thì hàm lượng triterpenoid thu được thấp 2,73 mg/g. Hoạt chất tăng nhanh khi trích ly ở 60 phút, với lượng triterpenoid thu được là 3,35 mg/g. Sau 90 phút trích ly, lượng triterpenoid thu được là 4,65 mg/g, sau 120 phút là 4,73 mg/g, có thể nhận thấy lượng triterpenoid tăng liên tục lý do ở đây là phải mất khoảng thời gian là 120 phút thì hàm lượng triterpenoid trong nguyên liệu được trích ly gần hết, bới khi tăng thời gian lên 150 phút hàm lượng triterpenoid thu được cũng không chênh lệch lớn đối với trích ly trong khoảng thời gian là 120 phút.
Nếu cứ tiến hành trích ly trong 150 phút sẽ là điều không có lợi cho sản xuất vì trong bất cứ nghiên cứu nào cũng cần đặt ra yêu cầu là tối thiểu hóa chi phí mà vẫn cho hiệu suất cao.
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian trích ly ở 120 phút là thời gian trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
4.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi nấm Linh Chi
Để tách triệt để các hoạt chất trong bã chúng tôi tiến hành trích ly bã thêm lần 2 và lần 3 thời gian là 2h trong dung môi nước nóng 90oC. Kết quả thu được như bảng và đồ thị sau:
Bảng 4.2.6. Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Số lần trích ly Trích ly lần 2 Trích ly lần 3
Hàm lượng
triterpenoid 0,098
a 0,023b
(Chú thích: Các giá trị trong cùng một hàng có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau ở mức ý nghĩa α = 0,05)
Hình 4.7. Đồ thị ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Dịch trích ly thu được đem tinh chế làm sạch, đo OD và xác định hàm lượng triterpenoid. Từ đó tìm được thời gian và số lần trích ly tối ưu cho hiệu suất cao nhất.
Từ bảng số liệu chúng tôi thấy quá trình trích ly lần 2 hàm triterpenoid là 0,098mg/g cao hơn so với lần trích ly 3 là 0,023 mg/g nguyên nhân là do trong quá trình trích ly lần 1 và lần 2 hàm lượng triterpenoid nói chung đã được chiết ra đáng kể.
Theo đó chúng tôi quyết định sẽ trích ly 2 lần trong quá trình trích ly chế
phẩm nấm Linh Chi
4.3. Quá trình thu nhận triterpenoid trong nấm Linh Chi
Dịch thu được sau quá trình trích ly có chứa hàm lượng triterpenoid không lớn và còn lẫn nhiều bã nguyên liệu sau quá trình trích ly, để thu được hàm lượng triterpenoid cao hơn và tinh sạch hơn ta cần tiến hành quá trình lọc dịch.
Trong quá trình làm các thí nghiệm, chúng tôi sử dụng 2 phương pháp lọc: Lọc bằng vải lọc nhiều lớp và lọc bằng giấy lọc. Chúng tôi nhận thấy:
+ Khi dịch được lọc bằng vải lọc nhiều lớp: Cho dịch trong, đẹp màu. Tuy nhiên, nếu để dịch sau một thời gian sẽ thấy một lớp cặn vẩn đục ởđáy.