M Ở ĐẦU
3.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quả
trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
a. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Nấm Linh Chi được làm nhỏ ở các kích thước khác nhau để có thể lựa chọn
được một kích thước tối ưu nhất. Linh Chi được thái lát, xay ở các kích thước phù hợp. Ởđây chúng tôi tiến hành khảo sát ở các loại kích thước:
- Thái lát mỏng: d > 10mm.
Nấm Linh Chi với các kích thước trên được đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cốđịnh các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu:
- Khối lượng mẫu: 2g
- Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
- Thời gian: 90 phút và nhiệt độ: 70oC - Sử dụng dung môi là etanol 90% - Tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là: 1/20
Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc. Sau đó đo OD để xác định triterpenoid. Thí nghiệm này xác định được kích thước nguyên liệu phù hợp nhất và dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
a. Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
Việc sử dụng loại dung môi nào cho trích ly là rất quan trọng , vì dung môi
để hoà tan các chất cần trích ly và hạn chế hòa tan các tạp chất, do đó dung môi có ảnh hưởng lớn tới chất lượng của dịch chiết và thành phẩm. Dựa trên tính chất vật lý (độ nhớt, sức căng bề mặt, độ phân cực) và đặc tính hoà tan chọn lọc của dung môi đối với hoạt chất
để lựa chọn dung môi. Được biết các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi có cả chất phân cực và không phân cực, một số chất tan trong nước, một số ít không tan trong nước mà tan trong các dung môi như methanol [16, 17], ethanol [25] và ethyl acetate [13]. Chọn dung môi cho việc trích ly các sản phẩm dùng cho thực phẩm, ngoài yếu tố
hoà tan chọn lọc cao, độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ, còn phải lưu ý đến tính độc của dung môi, quan tâm đến vấn đề kinh tế, rẻ tiền và dễ kiếm. Do đó, chúng tôi chọn nước là dung môi cho quá trình trích ly nấm Linh Chi và sử dụng dung môi này cho các nghiên cứu tiếp theo.
Dung môi : Methanol 90%; Ethanol 90%; Ethyl acetate 90% - Khối lượng mẫu: 2g
- Thời gian: 90 phút và nhiệt độ: 70oC - Độ mịn nguyên liệu : Theo mục 3.4.2.1.a - Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là: 1/20 - Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc. Sau đó đo OD để xác định triterpenoid. Thí nghiệm này xác định được dung môi phù hợp nhất và dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
Nồng độ dung môi: 80%; 85%; 90%; 95%. - Khối lượng mẫu: 2g
- Độ mịn nguyên liệu : Theo mục 3.4.2.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.2.2.a
- Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là: 1/20 - Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
- Thời gian trích ly: 90 phút và nhiệt độ trích ly: 70oC
Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc. Sau đó đo OD để xác định triterpenoid. Thí nghiệm này xác định ảnh hưởng của nồng độ của dung môi tối ưu nhất tới hiệu quả trích ly.
c. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Nấm Linh Chi khô, có độ ẩm ≤ 12%. Với các điều kiện thí nghiệm như sau Tỷ lệ dung môi: tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là: 1/20; 1/25, 1/30, 1/35 và 1/40.
Thông số trích ly : - Khối lượng mẫu: 2g
- Độ mịn nguyên liệu : Theo mục 3.4.2.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.2.2.a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 3.4.2.2.b - Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
- Thời gian trích ly: 90 phút và nhiệt độ trích ly: 70oC
Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thô và giấy lọc tinh. Đo OD để xác triterpenoid. Từ thí nghiệm này ta xác định được tỷ lệ nguyên liệu / dung môi tối ưu nhất.
d. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Nhiệt độ trích ly là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình trích ly các chất trong nấm Linh Chi Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát ở các nhiệt độ trích ly sau: 60, 70, 80, 90, 100oC.
Để tiến hành thí nghiệm dễ dàng, chúng tôi cốđịnh các điều kiện sau: Thông số trích ly:
- Khối lượng mẫu: 2g
- Độ mịn nguyên liệu: Mục 3.4.2.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.2.2.a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 3.4.2.2.b
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: Theo mục 3.4.2.2.c - Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
- Thời gian trích ly: 90 phút và nhiệt độ trích ly: 70oC
Dịch thu được đem tinh chế làm sạch, đo OD để xác định triterpenoid. Từđó sẽ tìm ra được nhiệt độ tối ưu cho hiệu quả trích ly cao nhất.
e. Ảnh hưởng của thời gian trích ly tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Thời gian trích ly có ảnh hưởng mạnh mẽ tới hiệu quả trích ly và cho phí năng lượng cũng như dung môi. Do đó, chúng tôi khảo sát ở các mức thời gian sau 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút ở cùng điều kiện sau:
- Khối lượng mẫu: 2g
- Độ mịn nguyên liệu: Theo mục 3.4.2.1a - Dung môi: Theo mục 3.4.2.2.a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 3.4.2.2.b
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: Theo mục 3.4.2.2.c - Nhiệt độ trích ly: Theo mục 3.4.2.2.d
- Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
Mỗi công thức lặp lại 3 lần. Dịch trích ly thu được đem lọc, đo OD để xác định
triterpenoid. Từđó sẽ tìm được phương pháp trích ly tối ưu cho hiệu quả cao nhất. f. Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Tiến hành trích ly nhiều lần nhằm mục đích tách triệt để hàm lượng β- glucan có trong nấm Linh Chi, tăng hiệu quả thu hồi. Bã Linh Chi ở lần trích ly 1 sẽđược tiến hành trích ly thêm lần 2 và lần 3 ở cùng một điều kiện sau:
- Khối lượng mẫu: 2g
- Độ mịn nguyên liệu: Theo mục 3.4.2.1a - Dung môi: Theo mục 3.4.2.2.a
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: Theo mục 3.4.2.2.c - Nhiệt độ trích ly: Theo mục 3.4.2.2.d
- Thời gian trích ly: Theo mục 3.4.2.2.e - Trích ly bằng thiết bị Soxhlet