M Ở ĐẦU
2.5.2.Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Linh Chi tại Việt Nam
* Tình hình sản xuất
Từ thập niên 90, nấm Linh Chi mới thực sự nuôi trồng nhiều ở Việt Nam. Ngoài ra, còn thấy 15 loài nấm Linh Chi mọc hoang dại ở rừng Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Phước, Gia Lai, Đăk Lắc. Tại hội nghị kết quả công tác chuyển giao công nghệ nuôi trồng nấm
ăn và nấm dược liệu, theo tài liệu đã được công bố tới nay có 32/61 tỉnh thành có cơ
sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001). Hiện nay có rất nhiều Viện, Trung tâm nghiên cứu về nấm Linh Chi ở cả Bắc và Nam nhằm lựa chọn những chủng có năng suất cao, phẩm chất tốt, phù hợp với khí hậu và đặc biệt có thể phổ biến đại trà cho các cơ sơ nuôi trồng ở một số nơi để tận dụng nguồn nguyên liệu cellulose có sẵn, tăng thu nhập cho người lao động. Mặt khác, nuôi trồng nấm Linh Chi để cung cấp nguồn dược liệu trong nước, bổ sung cho thực phẩm và một phần để xuất khẩu.
* Tình hình nghiên cứu
Hiện nay trong nước cũng rất quan tâm và có khá nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi .
Nhóm nghiên cứu Viện Công nghệ thực phẩm của T.S Trương Thị Hòa trong nghiên cứu “Trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi ” đã đã xác định
được phương pháp trích ly các hoạt chất sinh học sử dụng cho công nghệ sản xuất rượu bổ. Phương pháp trích ly bằng ethanol với tỷ lệ dung môi / nguyên liệu là 1/10
đạt hiệu suất cao (8,8%) khi chiết lần 1 bằng ethanol 960, lần 2 bằng ethanol 700, lần 3 bằng ethanol 450. Ngoài ra còn sử dụng enzyme Novozyme 342 (hỗn hợp của enzyme cellulase và hemicellulase) đạt hiệu suất cao nhất (10,2%) ởđiều kiên nhiệt
độ 600C, nồng độ enzyme 0,21% trong 120 phút. Ưu điểm của phương pháp trích lý bằng enzyme là cho hiệu suất trích ly cao, thời gian trích ly ngắn, nhiệt độ trích ly thấp, không ảnh hưởng tới một số hoạt chất sinh học mẫn cảm với nhiệt độ cao [14].
Bên cạnh đó, năm 2005, Nguyễn Đức Tiến và cộng sự thuộc Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ “Nghiên
cứu sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng” đã đưa được quy trình công nghệ cơ bản sản xuất trà Phytos hòa tan và đồ uống Thanh Xuân từ nấm Linh Chi. Năm 2006, Nguyễn Đức Tiến và cộng sự trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ “Nghiên
cứu tận dụng hạt nhãn và vỏ quả nhãn để làm thức ăn chăn nuôi và trồng nấm”, đã
đưa ra được quy trình công nghệ sử dụng hạt nhãn và vỏ quả nhãn để trồng nấm
Linh Chi [5, 4].
Theo kết quả của Nguyễn Thị Minh Tú trong nghiên cứu “Quy trình tách
chiết các hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi ” với dung môi là nước quá trình chiết
đạt tối ưu ở nhiệt độ 800C, thời gian chiết 7h, tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là 1/20 thì hàm lượng chất chiết thu hồi đạt 6,91% [10].
Tuy nhiên những nghiên cứu về nấm Linh Chi tại Việt Nam tập trung chủ
yếu vào điều tra, sưu tập, nêu đặc điểm phân loại, điều kiện sinh thái, quy mô nuôi trồng và các hoạt chất chính có trong nấm Linh Chi. Mặc dù đã có sản phẩm sản
Phần III
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, thiết bị và hóa chất nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng
- Nguồn nấm Linh Chi (Ganoderma lucidium) được trồng tại Hưng Yên. Đây là giống nấm Linh Chi đỏ có nguồn gốc từ Trung Quốc được nhân giống tại Viện Di truyền Nông nghiệp, nấm Linh Chi được thu mua có độẩm = 11%.
3.1.2. Thiết bị và hóa chất - Thiết bị: - Thiết bị:
+ Máy sấy (Grot DZ 47-63, Trung Quốc).
+ Máy đo OD (Zuzi 4110ED Spectrophotometer, Đức). + Cân phân tích (Precisa XT 320M, Thụy Sỹ).
+ Thiết bị Soxhlet (TC 15, Trung Quốc).
+ Cân kỹ thuật (Cent-0-Gram Balance, OHAUS, Mỹ). + Tủ lạnh (Samsung SR-15NFBA, Nhật bản).
- Hoá chất: Ethanol 96o
của Việt Nam, nước cất, ethanol, methanol, ethyl acetate Trung Quốc, H2SO4 Trung Quốc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dụng cụ
Nhiệt kế, bếp điện, giấy lọc, dụng cụ thủy tinh các loại (ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, phễu thủy tinh, pipet, buret,...), micropipet (Gilson, Pháp).
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và môi trường nông nghiệp - Viện Cơ điện Nông nghiệp và CNSTH, 126 Trung Kính, Trung Hòa, Cầu Giấy, Hà Nội.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 07/12/2013 đến tháng 07/06/2014.
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quả trích ly
- Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
3.3.2. Xác định các thông số của quá trình trích ly
- Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
- Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
- Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến quá trình trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
- Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi. - Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
3.3.3. Quá trình thu nhận triterpenoid trong nấm Linh Chi
- Làm sạch dịch trích ly
- Thu nhận và cô dịch trích ly
3.3.4. Quy trình công nghệ trích ly triterpenoid từ nấm Linh Chi
3.3.4.1. Phương pháp trích ly triterpenoid
Quy trình sản xuất chế phẩm nấm Linh Chi dự kiến:
Sơ đồ 3.1. Quy trình trích ly sản xuất chế phẩm triterpenoid từ nấm Linh Chi Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu: Nấm Linh Xử lý Trích ly Lọc Thu dịch Cô Chế phẩm triterpenoid d
1. Xử lý nguyên liệu
Nấm linh Chi khô được kiểm tra và lựa chon để loại bỏ mốc, hỏng (đạt các chỉ tiêu an toàn về vệ sinh thực phẩm), rồi đem nghiền nhỏ.
- Mục đích: Để tách các tạp chất không mong muốn, tăng diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi trích ly , phá vỡ cấu trúc tế bào thuận lợi cho các quá trình sau.
2. Công đoạn trích ly
Nấm Linh Chi sau khi xử lý nguyên liệu được đem đi trích ly bằng thiết bị
chuyên dụng với các thông số trích ly phù hợp.
- Mục đích: Tách tối đa các hoạt chất sinh học và các hợp chất hòa tan có trong nấm Linh Chi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Lọc dịch chiết
Sau khi trích ly dịch trích ly thu được là một hỗn hợp các chất, vì vậy dịch trích ly sẽ được lọc qua vải lọc để tách các tạp chất thô rồi cho vào lọc kỹ bằng giấy lọc thu được dịch chiết trong.
- Mục đích: Loại bỏ cặn, bã ra khỏi dịch trích ly nhằm thu được dịch trong chỉ chứa các hợp chất hòa tan.
4. Cô dịch trích ly
Sau khi lọc ta thu được dịch trích ly có hàm lượng nước lớn vì vậy ta tiến hành cô dịch trích ly trong nồi cô chân không ở nhiệt độ 100oC.
- Mục đích: Cô đặc loại bỏ một phần nước để tăng hàm lượng chất khô cho sản phẩm.
Sau khi cô dịch trích ly ta thu được chế phẩm triterpenoid từ nấm Linh Chi.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý
a) Phương pháp xác định độ ẩm (phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi)
- Nguyên tắc: Sấy mẫu trong thời gian dài để tách lượng nước tự do và nước liên kết bên trong sản phẩm. Trong quá trình sấy cần theo dõi và cân khối lượng mẫu đến khi khối lượng lần trước và lần sau nó không thay đổi thì dừng sấy. Lượng nước trong nguyên liệu đã bay hết, phần còn lại là chất khô.
- Công thức tính: Độẩm (W%) được tính theo công thức sau: W (%) = 100 0 1 2 1 × − − G G G G Trong đó:
G1: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g) G2: Khối lượng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g) G0: Khối lượng chén sứ (g).
b) Phương pháp đo mật độ quang dịch chiết (Theo TCVN 5367-91)
Dịch chiết thu được đem lọc sạch qua giấy lọc và bước sóng 548.1nm ( bước sóng hấp thụ riterpenoid).
Tiến hành: Bật máy đo quang phổ rồi để máy ổn định trong 10 phút. Tráng cuvet bằng nước cất. Trước khi đo mẫu cần đo bằng ethanol trước. Sau đó, lấy khoảng 3 ml dịch chiết của mẫu cho vào cuvet, đo trên máy ở bước sóng 548,1 nm.
c) Phương pháp xác định hàm lượng trietrpenoid
Lượng trietrpenoid được xác định bằng phương pháp đo mật độ chiết quang Phương pháp đo mật độ chiết quangdựa trên việc hấp thụ tại bước sóng 548,1 nm. Hàm lượng triterpenoid được xác định bằng cách so sánh với một đường chuẩn. Sử dụng máy quang phổ hấp thụ, chọn bước sóng 548,1 nm, xây dựng đường chuẩn, đo các mẫu phân tích.
* Xây dựng đường chuẩn
Quy trình lập đường chuẩn triterpenoid như sau:
- Cân chính xác 1,15 mg acid ursolic, hòa tan trong 10 ml ethyl acetate để
xây dựng đường chuẩn với các nồng độ acid ursolic là 0; 0,20; 0,40; 0,60; 0,80; 1 và 1,20 mg dung dịch được làm khô ở 100 0C.
- Sau đó thêm 0,40 ml dung dịch acid axetic và vanillin 5% -1 ml acid pecloric, ở 60oC / 15 phút sau đó di chuyển nó vào bồn nước đá, thêm 5 ml acid axetic, đặt nó ở nhiệt độ phòng trong 15 phút .
- Xác định độ hấp thụ của nó trong 548,1 nm.
Vẽđường chuẩn dựa trên kết quả xác định. Trọng lượng tiêu chuẩn trong phạm vi 0-0,14 mg cho thấy một mối quan hệ tuyến tính tốt với giá trị hấp thụ. Phương trình hồi quy tuyến tính là Y = 0,2158X - 0,0018, hệ số tương quan r = 0,9991.
* Kết quả xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn triterpenoid được dựng nhờ chương trình Microsoft Excel
được thể hiện ở phụ lục 1. Với trục tung là mật độ quang và trục hoành là nồng độ
chất chuẩn. Phương trình thể hiện mối tương quan giữa triterpenoid và OD548,1nm là:
y = 0,2158X - 0,0018 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó y là hàm lượng triterpenoid trong 1 ml dịch (mg/ml), x là giá trị
OD548,1nm tương ứng. Hệ số tương quan r = 0,999 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y
là chặt chẽ.
Dựa vào đường chuẩn, phương trình đường chuẩn y = 0,2158X - 0,0018 và
kết quả đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng 548,1nm của các mẫu phân tích, xác
định được nồng độ của các mẫu phân tích. Hàm lượng triterpenoid được xác đinh thông qua công thức dưới đây.
* Tính toán xác định hàm lượng triterpenoid trong sinh khối nấm Linh Chi
- Từđường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích. - Hàm lượng glucan được tính theo công thức sau:
Hàm lượng glucan (%) =
Trong đó: X: Số gam xác định từđường chuẩn V: Thể tích dịch trích ly
n: Là hệ số pha loãng
m: Là khối lượng mẫu ban đầu đem phân tích = 2g.
3.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quả
trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
a. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Nấm Linh Chi được làm nhỏ ở các kích thước khác nhau để có thể lựa chọn
được một kích thước tối ưu nhất. Linh Chi được thái lát, xay ở các kích thước phù hợp. Ởđây chúng tôi tiến hành khảo sát ở các loại kích thước:
- Thái lát mỏng: d > 10mm.
Nấm Linh Chi với các kích thước trên được đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cốđịnh các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu:
- Khối lượng mẫu: 2g
- Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
- Thời gian: 90 phút và nhiệt độ: 70oC - Sử dụng dung môi là etanol 90% - Tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là: 1/20
Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc. Sau đó đo OD để xác định triterpenoid. Thí nghiệm này xác định được kích thước nguyên liệu phù hợp nhất và dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
a. Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
Việc sử dụng loại dung môi nào cho trích ly là rất quan trọng , vì dung môi
để hoà tan các chất cần trích ly và hạn chế hòa tan các tạp chất, do đó dung môi có ảnh hưởng lớn tới chất lượng của dịch chiết và thành phẩm. Dựa trên tính chất vật lý (độ nhớt, sức căng bề mặt, độ phân cực) và đặc tính hoà tan chọn lọc của dung môi đối với hoạt chất
để lựa chọn dung môi. Được biết các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi có cả chất phân cực và không phân cực, một số chất tan trong nước, một số ít không tan trong nước mà tan trong các dung môi như methanol [16, 17], ethanol [25] và ethyl acetate [13]. Chọn dung môi cho việc trích ly các sản phẩm dùng cho thực phẩm, ngoài yếu tố
hoà tan chọn lọc cao, độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ, còn phải lưu ý đến tính độc của dung môi, quan tâm đến vấn đề kinh tế, rẻ tiền và dễ kiếm. Do đó, chúng tôi chọn nước là dung môi cho quá trình trích ly nấm Linh Chi và sử dụng dung môi này cho các nghiên cứu tiếp theo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung môi : Methanol 90%; Ethanol 90%; Ethyl acetate 90% - Khối lượng mẫu: 2g
- Thời gian: 90 phút và nhiệt độ: 70oC - Độ mịn nguyên liệu : Theo mục 3.4.2.1.a - Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là: 1/20 - Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc. Sau đó đo OD để xác định triterpenoid. Thí nghiệm này xác định được dung môi phù hợp nhất và dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
Nồng độ dung môi: 80%; 85%; 90%; 95%. - Khối lượng mẫu: 2g
- Độ mịn nguyên liệu : Theo mục 3.4.2.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.2.2.a
- Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là: 1/20 - Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
- Thời gian trích ly: 90 phút và nhiệt độ trích ly: 70oC
Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc. Sau đó đo OD để xác định triterpenoid. Thí nghiệm này xác định ảnh hưởng của nồng độ của dung môi tối ưu nhất tới hiệu quả trích ly.
c. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Nấm Linh Chi khô, có độ ẩm ≤ 12%. Với các điều kiện thí nghiệm như sau Tỷ lệ dung môi: tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là: 1/20; 1/25, 1/30, 1/35 và 1/40.
Thông số trích ly : - Khối lượng mẫu: 2g
- Độ mịn nguyên liệu : Theo mục 3.4.2.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.2.2.a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 3.4.2.2.b - Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
- Thời gian trích ly: 90 phút và nhiệt độ trích ly: 70oC
Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thô và giấy lọc tinh. Đo OD để xác triterpenoid. Từ thí nghiệm này ta xác định được tỷ lệ nguyên liệu / dung môi tối ưu nhất.
d. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi
Nhiệt độ trích ly là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình trích ly các chất trong nấm Linh Chi Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát ở các nhiệt độ trích ly sau: 60, 70, 80, 90, 100oC.
Để tiến hành thí nghiệm dễ dàng, chúng tôi cốđịnh các điều kiện sau: