Các dung dịch đệm pH từ 6,0 – 9, 0 cĩ thể pha bằng cách trộn 2 dung dịch Na2HPO4 0,2 M và dung dịch Acid citric 0,1 M theo tỷ lệ như bảng 2.1
Bảng 2.1 : Pha dung dịch đệm pH
Na2HPO4 0,2 M Acid citric 0,1 M pH
630ml 370 ml 6,0 700 ml 300ml 6,5 820 ml 180ml 7.0 920 ml 80 ml 7,5 970 ml 30 ml 8,0 990ml 10 ml 8,5 1000 ml 0 ml 9,0
Dùng máy đo pH để kiểm tra và hiệu chỉnh pH lại với dung dịch acid citric 0,1M hoặc natri phosphatdibasic 0,2 M (dùng các dung dịch chuẩn cĩ pH = 4; pH = 7,0; pH = 9, các dung dịch đệm phải được pha trong nước khơng cĩ CO2 ).
Hình 2.2. Đo và chỉnh pH các dung dịch đệm
2.2.3. Quy trình thủy phân da cá Basa bằng phương pháp dùng enzym alkalase
Dùng enzym thủy phân nhằm cắt đứt hay làm yếu đi những liên kết ngang như liên kết hydro – NH … O = C – của cấu trúc xoắn α, liên kết amid, liên kết ester -COO-, liên kết disulfur -S-S- của cấu trúc bậc III. Bên cạnh đĩ, sẽ cĩ một số ít liên kết peptid trong mạch chính của chuỗi polypeptid bị đứt. Kết quả là mạch colagen mở ra, cấu trúc bậc I và bậc II của nĩ bị biến đổi, các nhĩm chức năng nằm sâu bên trong xuất hiện ra ngồi và các đoạn polypeptid bị cắt ngắn dễ dàng chuyển vào nước.
Tiến hành như sau :
- Cân chính xác 100g da cá đã xử lý.
- Hút chính xác thể tích enzym Alkalase pha vừa đủ với thể tích dung dịch đệm (ở các pH thay đổi tư ø 6 – 9) với nồng độ enzym thay đổi tư ø: 0,005 – 0,1%
- Cho da cá Basa đã cân vào 200 ml dung dịch enzym đã pha, để cho da tiếp xúc với enzym ở nhiệt độ :37 – 60 0C và thời gian: 5 phút – 30 phút.
- Vớt da ra, dùng H2SO4 4N để bất hoạt enzym.
- Rửa da nhiều lần với nước sạch để lấy đi lượng thừa acid và lượng thừa enzym đã bị tiêu diệt.
- Thêm nước với tỉ lệ 1 : 1 (da : nước). Trích gelatin ở các nhiệt độ thay đổi từ 40 - 60 0C.
- Tinh chế và thu hồi gelatin : nhằm loại bỏ những thành phần sinh mùi, sinh màu, cặn lơ lửng, chất béo, … đồng thời nâng cao nồng độ gelatin gồm :
+ Lọc thơ để loại bỏ tạp chất khơng phải gelatin, ta được dịch lỏng của gelatin. + Cho thêm than hoạt tính với tỷ lệ 0,5% so với dịch gelatin. Đem lọc chân khơng, ta sẽ được dịch trong của gelatin tương đối tinh khiết : khơng màu, khơng mùi.
- Trải dịch gelatin thành lớp mỏng, làm khơ. Ta được gelatin khơ . - Tính hiệu suất sản phẩm.
- Xác định lực gel (độ Bloom) : thực hiện tại Cơng ty cổ phần Dược phẩm Cửu Long. Quy trình này cĩ thể tĩm tắt bằng sơ đồ 2.1 sau :
DA CÁ BASA (100 g)
Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết xuất gelatin từ da cá Basa Mỡ, máu, tạp
thơ DA CÁ đã xử lý thơ (cân) Rửa nước nhiều lần
Rửa= dd NaClO 0,005% DA CÁ SẠCH Dịch rửa Ép mỡ DA CÁ Enzym/dd đệm
Thủy phân, t0, thời gian Mỡ cá Da đã thủy phân Dịch enzym + H2O : Da (1 : 1) BM. t0 ,thới gian. Lọc
Tạp khơng tan Dịch gelatin thơ
Dịch gelatin Tạp (bỏ)
GELATIN SẢN PHẨM
Trải mỏng, làm khơ
DA CÁ BASA THƠ
Hình 2.3 . Da cá Basa đã thủy phân Hình 2.4 . Lọc dịch gelatin chiết được
Hình 2.5 . Sản phẩm gelatin trong bình hút ẩm
2.2.4. Thăm dị sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất gelatin từ da cá basa da cá basa
2.2.4.1. Thăm dị ảnh hưởng của nồng độ enzym alkalase
Khảo sát sư thay đổi nồng độ enzym trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố pH, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân và nhiệt độ chiết gelatin.
Eùp mỡ
A1õ A1õ
Bảng 2.2. Thăm dị ảnh hưởng của nồng độ enzym trên hiệu suất chiết gelatin.
[Enz]% 0,005 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,1 pH 7 7 7 7 7 7 7 7 t (phút) 15 15 15 15 15 15 15 15 T1 (0C) 37 37 37 37 37 37 37 37 T2 (0C) 50 50 50 50 50 50 50 50 Với :
[Enz] % : nồng độ enzym %, (số ml enzym Alkalase pha vừa đủ với 100ml dung dịch đệm)
t (phút) : thời gian thủy phân T1 (0C) : nhiệt độ thủy phân T2 (0C) : nhiệt độ chiết gelatin
2.2.4.2. Thăm dị ảnh hưởng thời gian thủy phân
Khảo sát sự thay đổi thời gian thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố : nồng độ enzym, pH, nhiệt độ thủy phân, và nhiệt độ chiết gelatin.
Bảng 2.3. Thăm dị ảnh hưởng của thời gian thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin.
t (phút) 5 10 15 20 25 30 [Enz]% 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 pH 7 7 7 7 7 7 T1 (0C) 37 37 37 37 37 37 T2 (0C) 50 50 50 50 50 50 Với :
[Enz] % : nồng độ enzym % (số ml enzym Alkalase pha vừa đủ với 100ml dung dịch đệm)
t (phút) : thời gian thủy phân T1 (0C) : nhiệt độ thủy phân T2 (0C) : nhiệt độ chiết gelatin
2.2.4.3. Thăm dị ảnh hưởng pH mơi trường thủy phân
Khảo sát sự thay đổi pH mơi trường thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố : nồng độ enzym, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân và nhiệt độ chiết gelatin.
Bảng 2.4. Thăm dị ảnh hưởng của pH mơi trường thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin.
pH 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 [Enz]% 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 t (phút) 15 15 15 15 15 15 15 T1 (0C) 37 37 37 37 37 37 37 T2 (0C) 50 50 50 50 50 50 50 Với :
[Enz] % : nồng độ enzym % (số ml enzym Alkalase pha vừa đủ với 100ml dung dịch đệm)
t (phút) : thời gian thủy phân T1 (0C) : nhiệt độ thủy phân T2 (0C) : nhiệt độ chiết gelatin
2.2.4.4. Thăm dị ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân
Khảo sát sự thay nhiệt độ thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố : nồng độ enzym, pH, thời gian thủy phân và nhiệt độ chiết gelatin.
Bảng 2.5. Thăm dị ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin.
T1 (0C) 37 40 45 50 55 60 [Enz]% 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 pH 7 7 7 7 7 7 t (phút) 15 15 15 15 15 15 T2 (0C) 50 50 50 50 50 50 Với :
[Enz] % : nồng enzym % (số ml enzym Alkalase pha vừa đủ với 100ml dung dịch đệm)
t (phút) : thời gian thủy phân T1 (0C) : nhiệt độ thủy phân T2 (0C) : nhiệt độ chiết gelatin
2.2.4.5. Thăm dị ảnh hưởng của nhiệt độ chiết gelatin ra khỏi da cá
Khảo sát sự thay đổi nhiệt độ chiết gelatin trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố : nồng độ enzym, pH, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân.
Bảng 2.6. Thăm dị ảnh hưởng của nhiệt độ chiết gelatin trên hiệu suất chiết gelatin.
T2 (0C) 40 45 50 55 60 [Enz]% 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 pH 7 7 7 7 7 t (phút) 15 15 15 15 15 T1 (0C) 37 37 37 37 37 Với :
[Enz] % : nồng độ enzym % (số ml enzym Alkalase pha vừa đủ với 100ml dung dịch đệm)
t (phút) : thời gian thủy phân T1 (0C) : nhiệt độ thủy phân T2 (0C) : nhiệt độ chiết gelatin
2.2.5. Thăm dị nhân quả
Bao gồm các giai đoạn :
2.2.5.1. Thiết kế các mơ hình thực nghiệm
Sau quá trình thăm dị sơ bộ xác định các biến độc lập (các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất gelatin), các biến phụ thuộc và các mức của các biến độc lập theo các quy trình trên. Khi chọn được các biến phụ thuộc và các mức cho các biến độc lập chúng tơi tiến hành thiết kế mơ hình thực nghiệm bằng phần mềm thiết kế Design – Expert 6.0 với các yếu tố sau :
+ Nồng độ enzym. + pH.
+ Thời gian thủy phân. + Nhiệt độ thủy phân. + Nhiệt độ chiết xuất.
Mỗi yếu tố gồm những mức khác nhau được chọn sau quá trình thăm dị sơ bộ
2.2.5.2. Khảo sát các mơ hình thực nghiệm
Tiến hành thực hiện các mơ hình thực nghiệm được xây dựng bởi phần mềm Design – Expert theo như quy trình đã mơ tả ở sơ đồ 2.1..
2.2.6. Tối ưu hĩa thơng số qui trình
Kết quả khảo sát thực nghiệm các mơ hình đã thiết kế được dùng làm dữ liệu đầu vào để thiết lập các thơng số tối ưu của quy trình chiết xuất gelatin bằng enzym alkalase.
2.2.7. Đánh giá quy trình tối ưu
Từ các thơng số tối ưu (các biến độc lập), tiến hành thực nghiệm quy trình tối ưu 2 – 3 lần để kiểm chứng tính chất dự đốn (các biến phụ thuộc).
So sánh hiệu suất và độ Bloom giữa các mơ hình thực nghiệm và giữa giá trị trung bình các mơ hình thực nghiệm với dự đốn của quy trình tối ưu bằng cách phân tích phương sai hai yếu tố khơng lặp (Anova : Two Factor Without Replication)
2.2.7.1. Đánh giá quy trình tối ưu về hiệu suất, lực gel. - Tính hiệu suất chiết gelatin trên lượng da sử dụng :
+ Gelatin sản phẩm được thực hiện theo các thơng số của quy trình tối ưu được làm khơ ở nhiệt độ thấp.
+ Cho vào bình hút ẩm cĩ Silicagel.
+ Cân Gelatin đã được hút ẩm đến trọng lượng khơng đổi. + Tính hiệu suất:
Hiệu suất gelatin thu được được tính theo cơng thức : y1 = (b x 100) / a
Trong đĩ :
y1 là hiệu suất % (khối lượng / khối lượng)
b là khối lượng gelatin sản phẩm thu được ở dạng khơ. a là khối lượng da cá tươi đã xử lý thơ.
- Đo lực gel (độ Bloom) [6]
Lực gel (độ Bloom) là khối lượng tính ra gam cần thiết để tạo ra một lực tác dụng lên piston cĩ đường kính 12,7 ± 0,1mm với bề mặt áp lực phẳng cĩ cạnh trịn (bán kính 0,5 mm),gây nên một sự lún sâu 4 mm trong gel cĩ nồng độ 6,67% (kl/kl) và đã làm đơng ở 10 0C.
Tiến hành :
Cho 7,5 g chế phẩm vào chai. Thêm 105 ml nước, đậy chai bằng mặt kính đồng hồ và để yên trong 3 giờ. Đun nĩng trong cách thủy ở 65 0C trong 15 phút. Để ở nhiệt độ phịng trong 15 phút và chuyển chai vào bình điều nhiệt ở 10 0C ± 0,1 0C và được lắp một thiết bị thích hợp đảm bảo bề mặt trên đĩ đặt chai nằm ngang hồn tồn. Đậy chai bằng nút cao su và để yên trong 16 – 18 giờ. Chuyển ngay chai vào máy đo độ bền gel và điều chỉnh sao cho piston tiếp xúc với bề mặt gel mà khơng sử dụng áp lực. Tăng tải trọng trên piston ở tốc độ 40 g /s đến khi piston đã lún sâu 4 ± 0,1mm.
Trọng tải mà piston sử dụng tại thời điểm đĩ, tính ra gam, biểu thị độ bền của gel (độ Bloom)
2..2.7.2. So sánh phương sai hai yếu tố khơng lặp
Phương sai phản ánh độ phân tán của chuỗi dữ liệu được quan sát. Dữ liệu càng phân tán thì phương sai càng lớn, tức là phương pháp phân tích càng kém chính xác.
So sánh phương sai của các kết quả thực nghiệm và kết quả thực nghiệm và dự đốn là so sánh gián tiếp sự khác nhau hay khác nhau khơng cĩ ý nghĩa của các kết quả thực nghiệm và giữa thực nghiệm và dự đốn.
2.2.8. Kiểm nghiệm sản phẩm [6]
Ngồi tiêu chuẩn về lực gel, các tiêu chuẩn khác của gelatin được kiểm nghiệm theo Dược điển Việt Nam III (DĐVN III) gồm :
2.2.8.1. Định tính
- Thêm 0,05 ml dung dịch đồng sulfat 12,5 % vào 2 ml dung dịch S. Trộn đều và thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxyd lỗng (TT). Màu tím phải được tạo thành. - Thêm vào 0,5 g chế phẩm trong một ống nghiệm chứa 10 ml nước. Để yên 10 phút, đun nĩng ở 60 0C trong 15 phút và giữ ống thẳng đứng ở 0 0C trong 6 giờ. Xoay ngược ống, dung dịch trong ống khơng được chảy ra ngồi ngay lập tức.
2.2.8.2. Độ trong và màu sắc của dung dịch
Dung dịch S (dung dịch gelatin để kiểm nghiệm): Hịa tan 1 g chế phẩm trong nước khơng cĩ carbon dioxyd (TT) ở khoảng 55 0C, pha lỗng thành 100 ml với cùng dung mơi và giữ dung dịch ở nhiệt độ này để tiến hành các phép thử.
Dung dịch S khơng được cĩ màu đậm hơn màu mẫu V4 (phụ lục 5.17, tr 2 DĐVN III) và khơng được đục hơn độ đục mẫu S4 (phụ lục 5.1 tr 20 DĐVN III).
2.2.8.3. Xác định độ ẩm [6]
Khơng được quá 15 %, (phụ lục 5.16 DĐVN III) (1,000g; 100 – 105 0C)
Là phương pháp loại nước ra khỏi sản phẩm bằng cách làm cho nước bay hơi ở những điều kiện nhiệt độ và áp suất nhất định. Thơng thường, nước được tách ra khỏi sản phẩm bằng cách sấy ở 105 0C dưới áp suất thường. Thực nghiệm cĩ thể tiến hành trong tủ sấy hay trong một thiết bị đặc biệt là cân xác định độ ẩm.
Xác định độ ẩm bằng cân xác định độ ẩm :
Trải mỏng 1g sản phẩm đã được cắt nhỏ trên đĩa cân và tiến hành xác định độ ẩm. Đọc kết quả.
Hình 2.6 . Máy xác định độ ẩm bằng quang phổ
2..2.8.4. Độ tro tồn phần [6]
Khơng được quá 2,0 % (phụ lục 7.6 DĐVN III) [6]
Trước khi xác định độ tro phải tiến hành xác định độ ẩm trước.
Tro tồn phần là cắn vơ cơ cịn lại sau khi ta đốt cháy hồn tồn một dược liệu. Các ion trong tro tồn phần dưới dạng carbonat hay oxyd.
Tiến hành:
Nung một chén nung bằng sứ cho tới khi trọng lượng khơng đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén.
Cân chính xác 1 g sản phẩm cho vào chén nung. Trải đều gelatin ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi gelatin cháy hồn tồn và chén khơng cịn bốc khĩi.
Đặt chén vào lị nung ở 575 – 625 0C cho đến khi vơ cơ hĩa hồn tồn (tro khơng cịn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lượng cân.
Đặt chén đựng tro vào lị nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân.
Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả hai lần cân liên tiếp giống nhau hoặc chênh lệch nhau khơng quá 0,5 mg. Tính kết quả :
Tro tồn phần tính trên gelatin khơ kiệt theo cơng thức : A% = [(a – b) x 100]% / [c – (c x h)]
A% : phần trăm tro tồn phần của gelatin. a : khối lượng chén cĩ tro.
b : khối lượng chén khơng. c : khối lượng gelatin dùng. h : phần trăm độ ẩm của gelatin.
Hình 2.7 . Xác định độ tro Hình 2.8 . Lị nung để xác định độ tro
Hình 2.9 . Cân để xác định độ tro
2.2.8.5. pH
2.2.8.6. Peroxyd
Khơng được quá 0,01 %
Hịa tan 1 g chế phẩm trong ml nước bằng cách đun nĩng và thêm 2 ml Divanadi pentoxyd trong acid sulfuric (TT). Bất kỳ màu vàng cam nào của dd cũng khơng được đậm hơn màu mẫu đối chiếu được chuẩn bị trong cùng điều kiện với một hỗn hợp của 1ml dung dịch hydrogen peroxyd 0,01 % và 9 ml nước.
2.2.8.8. Arsen
Khơng được quá 1 ppm (phụ lục 7.4.2 DĐVN III)
Thêm vào 1 g chế phẩm một hỗn hợp của 10 ml nước; 2,5 ml acid sulfuric (TT), 2,5 ml acid nitric (TT) và một lượng dư nước brom (TT). Để yên 30 phút và đun sơi dưới ống sinh hàn ngược trong 1 giờ. Lấy dung dịch này tiến hành thử theo phương pháp A (DĐVN III).
2.2.8.9. Kim loại nặng
Khơng được quá 50 ppm (phụ lục 7.4.7 DĐVN III)
Lấy 2 g chế phẩm tiến hành thử theo phương pháp 3 (DĐVN III), dùng 10 ml chì mẫu 10 phần triệu để chuẩn bị mẫu đối chiếu.
2.2.8.10. Độ nhiễm khuẩn
Tổng số vi khuẩn hiếu khí cĩ khả năng sống lại được khơng được quá 1.000 trong 1 g chế phẩm. Xác định bằng pp đĩa thạch (phụ lục 10.7 DĐVN III).
Chế phẩm phải khơng cĩ Escherichia coli và Salmonela (phụ lục 10.7 DĐVN III) Bảo quản : trong chai lọ kín.
DA CÁ BASA (100 g)
Chương 3 – KẾT QUẢ VAØ BAØN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ THĂM DỊ SƠ BỘ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁTRÌNH CHIẾT XUẤT GELATIN TỪ DA CÁ BASA TRÌNH CHIẾT XUẤT GELATIN TỪ DA CÁ BASA
3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzym
Khảo sát sự thay đổi nồng độ enzym trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố pH, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân và nhiệt độ chiết gelatin (theo bảng 2.2).
Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 3.1 sau :
Bảng 3.1. Kết quả thăm dị sơ bộ ảnh hưởng của [Enz] trên hiệu suất chiết và lực gel
[Enz]% 0,005 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,1