1.9.1. Xem kết quả tối ưu hĩa
Trong kết quả tối ưu hĩa của phần mềm thơng minh cĩ : * Các giá trị tối ưu của nguyên liệu hay điều kiện sản xuất.
y : giá trị thực nghiệm
y : giá trị dự đốn nội ( R2 luyện) hoặc giá trị dự đốn chéo (R2 thử)
* Giá trị dự đốn của tính chất sản phẩm.
1.9.2. Đánh giá cơng thức tối ưu
Cơng thức tối ưu hĩa cĩ thể được đánh giá thơng qua : * Sản xuất thử với cơng thức tối ưu (nên làm 2 – 3 lần).
* So sánh các giá trị dự đốn (từ cơng thức được tối ưu hĩa bởi phần mềm thơng minh) với các giá trị thực nghiệm.
Việc so sánh các giá trị dự đốn với giá trị thực nghiệm cĩ thể được thực hiện theo một trong hai cách :
- Xem xét hệ số tương quan Ry.yâ ;
- Trắc nghiệm giả thuyết (phân tích phương sai 2 yếu tố khơng lặp).
DA CÁ BASA (100 g)
Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VAØ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU VAØ TRANG THIẾT BỊ 2.1.1. Nguyên liệu
Da cá Basa cịn tươi hay được đơng lạnh, khơng bị thối rữa, khơng bị ơi khét được cung cấp bởi Cơng ty cổ phần xuất nhập khẩu thủy sản Agifish – An giang.
Địa chỉ : 1234 đường Trần Hưng Đạo, tỉnh An Giang.
2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu2.1.2.1. Dụng cụ 2.1.2.1. Dụng cụ
- Cân phân tích Sartorius cĩ độ nhạy 0,0001g ( Sartorius AG goettingen – Đức) - Máy đo pH Wissenschaflich – technische Werkstaten Germany.
Serial N0 : 53049018
- Nồi cách thủy cĩ điều chỉnh nhiệt độ Memmert Model WB 14. Serial N0 : 1498 - 0514
- Bình hút ẩm cĩ silicagen khan - Máy đo độ ẩm Sartorius MA – 45
- Lị nung Carbolite Model FLF 11/14B Serial No: 20. 302107 - Máy hút chân khơng.
- Máy ép mỡ. - Tủ lạnh. - Máy cơ quay.
2.1.2.2. Hĩa chất
- H2SO4 4N (Trung Quốc, AR) - Na2HPO4 0,2M (Trung Quốc, AR) - Acid citric 0,1M (Trung Quốc, AR) - Than hoạt tính (Trung Quốc, AR) - Bột trợ lọc Diatomid (Trung Quốc, AR)
2.1.2.3. Enzym: Alkalase (AF) do hãng Novozymes Denmark cung cấp, được pha lỗng thành các nồng độ khác nhau : 0,01%; 0,02% ; 0,03% ; 0,04% ; 0,05% ; 0,06% ; …
2.1.2.4. Phần mềm ứng dụng
- Phần mềm thiết kế: Design – Expert v6, 2002 (Stat – Ease Inc, USA)
- Phần mềm khảo sát mối liên quan nhân quả: FormRules V2, 2003 (Intelligensys Ltd., UK).
- Phần mềm tối ưu hĩa: INForm 3.0, 2003 (Intelligensys Ltd., UK). - Phần mềm Ms – Excel.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thực hiện các giai đoạn tiền thăm dị các yếu tố ảnh hưởng, rồi mới đưa các thơng số vào việc thiết kế mơ hình tối ưu.
2.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu2.2.1.1. Sơ chế nguyên liệu 2.2.1.1. Sơ chế nguyên liệu
Da cá cĩ thể được sử dụng tươi hay cĩ thể được sấy khơ một phần đến một hàm lượng chất rắn khoảng 65 -70%, cĩ thể dùng dưới dạng nguyên hay cắt thành từng mảnh (kích thước 10 -30 cm), hay nghiền thành mảnh vụn (kích thước 5 – 15 mm).
2.2.1.2. Loại tạp và khử trùng
Trong da cá ngồi thành phần chính là collagen, cịn cĩ những chất khác cần phải loại bỏ trong quá trình chiết xuất gelatin:
- Da cá được rửa sạch để loại những tạp chất như mỡ, máu, thịt cá …. - Để ráo nước, cân.
- Rửa sạch da nhiều lần với nước sạch trong mơi trường oxy-hĩa nhẹ (là dung dịch nước của một tác nhân oxy- hĩa như H2O2 hay NaClO, KClO) cĩ nồng độ từ 50 – 1000 ppm (0,005 – 0,1%), nhằm loại bỏ và ngăn chặn hoạt động của vi khuẩn để đem lại phẩm chất tốt cho gelatin sản phẩm.
2.2.1.3. Loại mỡ
- Dùng máy ép để loại mỡ cá, vì mỡ chiếm một tỷ lệ khá cao trong da. Nếu gelatin sản phẩm cĩ nhiều mỡ sẽ dẫn đến tình trạng: gelatin cịn mùi tanh của cá, mờ đục, và nhất là bị giảm độ gel, độ bền do dễ bị oxy hĩa, do đĩ làm giảm giá trị kinh tế của sản phẩm.
- Nếu cĩ điều kiện nên tiến hành thủy phân ngay để tiếp tục quy trình. - Nếu chưa tiến hành ngay thì phải bảo quản ở nhiệt độ thấp: 0 - -20 0C. (Khi thực hiện quy trình chiết xuất thì phải rã đơng).
Hình 2.1 . Máy ép mỡ bằng tay
2.2.2. Pha chế dung dịch đệm pH
Các dung dịch đệm pH từ 6,0 – 9, 0 cĩ thể pha bằng cách trộn 2 dung dịch Na2HPO4 0,2 M và dung dịch Acid citric 0,1 M theo tỷ lệ như bảng 2.1
Bảng 2.1 : Pha dung dịch đệm pH
Na2HPO4 0,2 M Acid citric 0,1 M pH
630ml 370 ml 6,0 700 ml 300ml 6,5 820 ml 180ml 7.0 920 ml 80 ml 7,5 970 ml 30 ml 8,0 990ml 10 ml 8,5 1000 ml 0 ml 9,0
Dùng máy đo pH để kiểm tra và hiệu chỉnh pH lại với dung dịch acid citric 0,1M hoặc natri phosphatdibasic 0,2 M (dùng các dung dịch chuẩn cĩ pH = 4; pH = 7,0; pH = 9, các dung dịch đệm phải được pha trong nước khơng cĩ CO2 ).
Hình 2.2. Đo và chỉnh pH các dung dịch đệm
2.2.3. Quy trình thủy phân da cá Basa bằng phương pháp dùng enzym alkalase
Dùng enzym thủy phân nhằm cắt đứt hay làm yếu đi những liên kết ngang như liên kết hydro – NH … O = C – của cấu trúc xoắn α, liên kết amid, liên kết ester -COO-, liên kết disulfur -S-S- của cấu trúc bậc III. Bên cạnh đĩ, sẽ cĩ một số ít liên kết peptid trong mạch chính của chuỗi polypeptid bị đứt. Kết quả là mạch colagen mở ra, cấu trúc bậc I và bậc II của nĩ bị biến đổi, các nhĩm chức năng nằm sâu bên trong xuất hiện ra ngồi và các đoạn polypeptid bị cắt ngắn dễ dàng chuyển vào nước.
Tiến hành như sau :
- Cân chính xác 100g da cá đã xử lý.
- Hút chính xác thể tích enzym Alkalase pha vừa đủ với thể tích dung dịch đệm (ở các pH thay đổi tư ø 6 – 9) với nồng độ enzym thay đổi tư ø: 0,005 – 0,1%
- Cho da cá Basa đã cân vào 200 ml dung dịch enzym đã pha, để cho da tiếp xúc với enzym ở nhiệt độ :37 – 60 0C và thời gian: 5 phút – 30 phút.
- Vớt da ra, dùng H2SO4 4N để bất hoạt enzym.
- Rửa da nhiều lần với nước sạch để lấy đi lượng thừa acid và lượng thừa enzym đã bị tiêu diệt.
- Thêm nước với tỉ lệ 1 : 1 (da : nước). Trích gelatin ở các nhiệt độ thay đổi từ 40 - 60 0C.
- Tinh chế và thu hồi gelatin : nhằm loại bỏ những thành phần sinh mùi, sinh màu, cặn lơ lửng, chất béo, … đồng thời nâng cao nồng độ gelatin gồm :
+ Lọc thơ để loại bỏ tạp chất khơng phải gelatin, ta được dịch lỏng của gelatin. + Cho thêm than hoạt tính với tỷ lệ 0,5% so với dịch gelatin. Đem lọc chân khơng, ta sẽ được dịch trong của gelatin tương đối tinh khiết : khơng màu, khơng mùi.
- Trải dịch gelatin thành lớp mỏng, làm khơ. Ta được gelatin khơ . - Tính hiệu suất sản phẩm.
- Xác định lực gel (độ Bloom) : thực hiện tại Cơng ty cổ phần Dược phẩm Cửu Long. Quy trình này cĩ thể tĩm tắt bằng sơ đồ 2.1 sau :
DA CÁ BASA (100 g)
Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết xuất gelatin từ da cá Basa Mỡ, máu, tạp
thơ DA CÁ đã xử lý thơ (cân) Rửa nước nhiều lần
Rửa= dd NaClO 0,005% DA CÁ SẠCH Dịch rửa Ép mỡ DA CÁ Enzym/dd đệm
Thủy phân, t0, thời gian Mỡ cá Da đã thủy phân Dịch enzym + H2O : Da (1 : 1) BM. t0 ,thới gian. Lọc
Tạp khơng tan Dịch gelatin thơ
Dịch gelatin Tạp (bỏ)
GELATIN SẢN PHẨM
Trải mỏng, làm khơ
DA CÁ BASA THƠ
Hình 2.3 . Da cá Basa đã thủy phân Hình 2.4 . Lọc dịch gelatin chiết được
Hình 2.5 . Sản phẩm gelatin trong bình hút ẩm
2.2.4. Thăm dị sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất gelatin từ da cá basa da cá basa
2.2.4.1. Thăm dị ảnh hưởng của nồng độ enzym alkalase
Khảo sát sư thay đổi nồng độ enzym trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố pH, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân và nhiệt độ chiết gelatin.
Eùp mỡ
A1õ A1õ
Bảng 2.2. Thăm dị ảnh hưởng của nồng độ enzym trên hiệu suất chiết gelatin.
[Enz]% 0,005 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,1 pH 7 7 7 7 7 7 7 7 t (phút) 15 15 15 15 15 15 15 15 T1 (0C) 37 37 37 37 37 37 37 37 T2 (0C) 50 50 50 50 50 50 50 50 Với :
[Enz] % : nồng độ enzym %, (số ml enzym Alkalase pha vừa đủ với 100ml dung dịch đệm)
t (phút) : thời gian thủy phân T1 (0C) : nhiệt độ thủy phân T2 (0C) : nhiệt độ chiết gelatin
2.2.4.2. Thăm dị ảnh hưởng thời gian thủy phân
Khảo sát sự thay đổi thời gian thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố : nồng độ enzym, pH, nhiệt độ thủy phân, và nhiệt độ chiết gelatin.
Bảng 2.3. Thăm dị ảnh hưởng của thời gian thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin.
t (phút) 5 10 15 20 25 30 [Enz]% 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 pH 7 7 7 7 7 7 T1 (0C) 37 37 37 37 37 37 T2 (0C) 50 50 50 50 50 50 Với :
[Enz] % : nồng độ enzym % (số ml enzym Alkalase pha vừa đủ với 100ml dung dịch đệm)
t (phút) : thời gian thủy phân T1 (0C) : nhiệt độ thủy phân T2 (0C) : nhiệt độ chiết gelatin
2.2.4.3. Thăm dị ảnh hưởng pH mơi trường thủy phân
Khảo sát sự thay đổi pH mơi trường thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố : nồng độ enzym, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân và nhiệt độ chiết gelatin.
Bảng 2.4. Thăm dị ảnh hưởng của pH mơi trường thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin.
pH 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 [Enz]% 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 t (phút) 15 15 15 15 15 15 15 T1 (0C) 37 37 37 37 37 37 37 T2 (0C) 50 50 50 50 50 50 50 Với :
[Enz] % : nồng độ enzym % (số ml enzym Alkalase pha vừa đủ với 100ml dung dịch đệm)
t (phút) : thời gian thủy phân T1 (0C) : nhiệt độ thủy phân T2 (0C) : nhiệt độ chiết gelatin
2.2.4.4. Thăm dị ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân
Khảo sát sự thay nhiệt độ thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố : nồng độ enzym, pH, thời gian thủy phân và nhiệt độ chiết gelatin.
Bảng 2.5. Thăm dị ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân trên hiệu suất chiết gelatin.
T1 (0C) 37 40 45 50 55 60 [Enz]% 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 pH 7 7 7 7 7 7 t (phút) 15 15 15 15 15 15 T2 (0C) 50 50 50 50 50 50 Với :
[Enz] % : nồng enzym % (số ml enzym Alkalase pha vừa đủ với 100ml dung dịch đệm)
t (phút) : thời gian thủy phân T1 (0C) : nhiệt độ thủy phân T2 (0C) : nhiệt độ chiết gelatin
2.2.4.5. Thăm dị ảnh hưởng của nhiệt độ chiết gelatin ra khỏi da cá
Khảo sát sự thay đổi nhiệt độ chiết gelatin trên hiệu suất chiết gelatin với sự cố định các yếu tố : nồng độ enzym, pH, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân.
Bảng 2.6. Thăm dị ảnh hưởng của nhiệt độ chiết gelatin trên hiệu suất chiết gelatin.
T2 (0C) 40 45 50 55 60 [Enz]% 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 pH 7 7 7 7 7 t (phút) 15 15 15 15 15 T1 (0C) 37 37 37 37 37 Với :
[Enz] % : nồng độ enzym % (số ml enzym Alkalase pha vừa đủ với 100ml dung dịch đệm)
t (phút) : thời gian thủy phân T1 (0C) : nhiệt độ thủy phân T2 (0C) : nhiệt độ chiết gelatin
2.2.5. Thăm dị nhân quả
Bao gồm các giai đoạn :
2.2.5.1. Thiết kế các mơ hình thực nghiệm
Sau quá trình thăm dị sơ bộ xác định các biến độc lập (các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất gelatin), các biến phụ thuộc và các mức của các biến độc lập theo các quy trình trên. Khi chọn được các biến phụ thuộc và các mức cho các biến độc lập chúng tơi tiến hành thiết kế mơ hình thực nghiệm bằng phần mềm thiết kế Design – Expert 6.0 với các yếu tố sau :
+ Nồng độ enzym. + pH.
+ Thời gian thủy phân. + Nhiệt độ thủy phân. + Nhiệt độ chiết xuất.
Mỗi yếu tố gồm những mức khác nhau được chọn sau quá trình thăm dị sơ bộ
2.2.5.2. Khảo sát các mơ hình thực nghiệm
Tiến hành thực hiện các mơ hình thực nghiệm được xây dựng bởi phần mềm Design – Expert theo như quy trình đã mơ tả ở sơ đồ 2.1..
2.2.6. Tối ưu hĩa thơng số qui trình
Kết quả khảo sát thực nghiệm các mơ hình đã thiết kế được dùng làm dữ liệu đầu vào để thiết lập các thơng số tối ưu của quy trình chiết xuất gelatin bằng enzym alkalase.
2.2.7. Đánh giá quy trình tối ưu
Từ các thơng số tối ưu (các biến độc lập), tiến hành thực nghiệm quy trình tối ưu 2 – 3 lần để kiểm chứng tính chất dự đốn (các biến phụ thuộc).
So sánh hiệu suất và độ Bloom giữa các mơ hình thực nghiệm và giữa giá trị trung bình các mơ hình thực nghiệm với dự đốn của quy trình tối ưu bằng cách phân tích phương sai hai yếu tố khơng lặp (Anova : Two Factor Without Replication)
2.2.7.1. Đánh giá quy trình tối ưu về hiệu suất, lực gel. - Tính hiệu suất chiết gelatin trên lượng da sử dụng :
+ Gelatin sản phẩm được thực hiện theo các thơng số của quy trình tối ưu được làm khơ ở nhiệt độ thấp.
+ Cho vào bình hút ẩm cĩ Silicagel.
+ Cân Gelatin đã được hút ẩm đến trọng lượng khơng đổi. + Tính hiệu suất:
Hiệu suất gelatin thu được được tính theo cơng thức : y1 = (b x 100) / a
Trong đĩ :
y1 là hiệu suất % (khối lượng / khối lượng)
b là khối lượng gelatin sản phẩm thu được ở dạng khơ. a là khối lượng da cá tươi đã xử lý thơ.
- Đo lực gel (độ Bloom) [6]
Lực gel (độ Bloom) là khối lượng tính ra gam cần thiết để tạo ra một lực tác dụng lên piston cĩ đường kính 12,7 ± 0,1mm với bề mặt áp lực phẳng cĩ cạnh trịn (bán kính 0,5 mm),gây nên một sự lún sâu 4 mm trong gel cĩ nồng độ 6,67% (kl/kl) và đã làm đơng ở 10 0C.
Tiến hành :
Cho 7,5 g chế phẩm vào chai. Thêm 105 ml nước, đậy chai bằng mặt kính đồng hồ và để yên trong 3 giờ. Đun nĩng trong cách thủy ở 65 0C trong 15 phút. Để ở nhiệt độ phịng trong 15 phút và chuyển chai vào bình điều nhiệt ở 10 0C ± 0,1 0C và được lắp một thiết bị thích hợp đảm bảo bề mặt trên đĩ đặt chai nằm ngang hồn tồn. Đậy chai bằng nút cao su và để yên trong 16 – 18 giờ. Chuyển ngay chai vào máy đo độ bền gel và điều chỉnh sao cho piston tiếp xúc với bề mặt gel mà khơng sử dụng áp lực. Tăng tải trọng trên piston ở tốc độ 40 g /s đến khi piston đã lún sâu 4 ± 0,1mm.
Trọng tải mà piston sử dụng tại thời điểm đĩ, tính ra gam, biểu thị độ bền của gel (độ Bloom)
2..2.7.2. So sánh phương sai hai yếu tố khơng lặp
Phương sai phản ánh độ phân tán của chuỗi dữ liệu được quan sát. Dữ liệu càng phân tán thì phương sai càng lớn, tức là phương pháp phân tích càng kém chính xác.
So sánh phương sai của các kết quả thực nghiệm và kết quả thực nghiệm và dự đốn là so sánh gián tiếp sự khác nhau hay khác nhau khơng cĩ ý nghĩa của các kết quả thực nghiệm và giữa thực nghiệm và dự đốn.
2.2.8. Kiểm nghiệm sản phẩm [6]
Ngồi tiêu chuẩn về lực gel, các tiêu chuẩn khác của gelatin được kiểm nghiệm theo Dược điển Việt Nam III (DĐVN III) gồm :
2.2.8.1. Định tính
- Thêm 0,05 ml dung dịch đồng sulfat 12,5 % vào 2 ml dung dịch S. Trộn đều và thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxyd lỗng (TT). Màu tím phải được tạo thành. - Thêm vào 0,5 g chế phẩm trong một ống nghiệm chứa 10 ml nước. Để yên 10 phút, đun nĩng ở 60 0C trong 15 phút và giữ ống thẳng đứng ở 0 0C trong 6 giờ. Xoay ngược ống, dung dịch trong ống khơng được chảy ra ngồi ngay lập tức.
2.2.8.2. Độ trong và màu sắc của dung dịch
Dung dịch S (dung dịch gelatin để kiểm nghiệm): Hịa tan 1 g chế phẩm trong nước khơng cĩ carbon dioxyd (TT) ở khoảng 55 0C, pha lỗng thành 100 ml với cùng dung mơi và giữ dung dịch ở nhiệt độ này để tiến hành các phép thử.
Dung dịch S khơng được cĩ màu đậm hơn màu mẫu V4 (phụ lục 5.17, tr 2