Tách chiết DNA tổng số và PCR
Phương pháp tách chiết DNA tổng số được mô tả ngắn gọn như sau: Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 5000 x g trong 10 phút, thu sinh khối, hòa tan sinh khối trong 0,5 ml đệm (Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS). Ủ phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Bổ sung 0,15 ml CH3COOK. Ly tâm 10000 x g trọng lượng tương đương isopropanol. Ly tâm ở 13000 x g trong 10 phút ở 4oC thu tủa. Rửa tủa bằng ethanol 70%. Làm khô tủa, hòa tan lại DNA với 50ul nước deion vô trùng.
Khuếch đại gen mã hóa 16S rRNA
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu: 27F (5' – AGAGTTTGATCMTGGCTCAG – 3') và 1492R (5' – TACGGYTACCTTGTTACGACTT – 3').
Thành phần PCR:
+ 5 mM dNTPs (Fermentas) : 1,5 µl + 10X Taq Buffer (Sigma) : 2,5 µl + 5 µM 27F (mồi xuôi) : 1 µl +5 µM 1492R (mồi ngược) : 1µl
+ DNA template : 1 µl
+ Taq DNA pol (Sigma) : 0,5 µl
+ H2O : 17,5
Tổng thể tích phản ứng : 25 µl
Chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 95oC trong 5 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (94oC trong 45 giây, 52oC trong 60 giây và 72oC trong 1 phút 30 giây). Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 72oC trong 5 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 10oC.
Sản phẩm PCR được tinh sạch và xác định trình tự tại hãng Macrogen Inc, Hàn Quốc. Kết quả trình tự được sử dụng để Blast lên ngân hàng dữ liệu Genbank NCBI, cho phép nhận diện loài trong mẫu nghiên cứu dựa vào độ tương đồng trong cấu trúc trình tự 16S rDNA.
40 2.4.14. Phương pháp sản xuất pho mát tươi
Thu sinh khối chủng giống
Chủng giống được nuôi trong bình tam giác, chứa 100 ml môi trường MRS, ở nhiệt độ thích hợp với từng chủng. Sau 20 giờ, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 30oC, thu sinh khối. Sinh khối được rửa bằng nước muối 0,85%, pH 7. Tiến hành ly tâm lần 2, 8000 vòng/ phút trong 5 phút ở 30oC. Sinh khối thu được được hòa với 20 ml sữa đã tiệt trùng. Lượng sinh khối này dùng để lên men 1 lít sữa.
Quy trình làm pho mát
Trong khuôn khổ của đề tài, chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn, được ứng dụng để thử nghiệm sản xuất loại pho mát tươi, không bổ sung rennet. Thực hiện theo mô tả của Ricki Carroll (2002) [67], có cải biến:
1. Sữa thanh trùng Mộc Châu đã được tiệt trùng 110oC/ 20 phút, được làm nguội xuống 30oC.
2. Cấy chủng giống vào sữa. 3. Ủ 30oC cho đến khi đông tụ.
4. Cắt quện sữa thành các ô vuông, kích thước 0,5 - 1 cm. Để yên 10 phút. 5. Gia nhiệt bằng phương pháp cách thủy sữa đông, tăng nhiệt từ 30 đến 45oC trong thời gian 40 phút (tốc độ tăng nhiệt 0,5oC/ 1phút).
6. Tách nước.
7. Treo quện sữa 14 giờ ở nhiệt độ phòng.
8. Bổ sung muối với lượng 600 mg/ 100g pho mát tươi. 9. Bảo quản tủ lạnh 4 – 6oC. Sử dụng trong 2 tuần.
Trước khi bảo quản, mẫu pho mát được đánh giá hương thơm. Đánh giá hương của pho mát tươi
Khả năng tạo hương của các chủng lactic trên mẫu pho mát được cảm quan theo phương pháp đánh giá mùi. Hội đồng gồm 9 thành viên. Các mẫu được đựng trong lọ thủy tinh (150g/ lọ) có nắp kín. Các thành viên thử bằng cách cảm quan, sau đó viết nhận xét. Sau mỗi lần thử, thành viên nghỉ 5 phút và uống nước trắng.
41
2.4.15. Tách hợp chất dễ bay hơi bằng phương pháp chưng cất
Phương pháp được thực hiện theo Magda. A. Abd El-Mageed (1997) [51], có cải biến.
Các hợp chất hương dễ bay hơi trong pha nước được chưng cất và trích ly sang pha dung môi chứa dietyl ete và n – hexan. 500g hỗn hợp gồm pho mát tươi và phần nước sữa tách ra quá trình sản xuất lượng pho mát trên được đồng nhất và đổ vào bình cầu dung tích 1 lít. Gia nhiệt dịch mẫu tới 100oC. Nước bay hơi, cuốn theo các hợp chất hương qua ống sinh hàn, hơi nước được làm lạnh, chảy xuống cột chứa dung môi dietyl ete : n – hexan (1:1). Tại đây, các cấu tử hương chiết sang pha dung môi, pha nước được hồi lưu vào bình chứa mẫu. Thời gian trích ly 3 giờ. Làm khô phần dung môi thu được bằng Na2SO4 khan và cô đặc ở nhiệt độ phòng. Bổ sung 100 µl dung môi để hòa tan hợp chất hương. Xác định thành phần hỗn hợp bằng thiết bị sắc kí khí khối phổ GC – MS Angilent technologie, chu trình nhiệt: Ban đầu 70oC giữ 5 phút, tăng nhiệt lên 230oC với mức 5oC/phút và giữ ở 230oC trong 5 phút; khối phổ theo phương pháp ion hóa sử dụng dòng electron với năng lượng 70eV, nhiệt độ nguồn ion 200oC.
42
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu đặc điểm của giống khởi động cho sản xuất pho mát
Bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm gồm khoảng 280 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy ở nhiều sản phẩm lên men lactic từ sữa, rau quả, ngũ cốc tới thịt, cá... lên men và một số chủng là trao đổi. Trong khuôn khổ của đề tài, 38 chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc chủ yếu từ sữa, các sản phẩm lên men từ sữa và một số chủng trao đổi được quan tâm nghiên cứu trước tiên. Nguồn phân lập, sưu tập giống của các chủng được thống kê ở bảng 3.1 dưới đây.
Bảng 3.1. Thống kê các chủng vi khuẩn lactic được khảo sát STT Ký hiệu
chủng Nguồn mẫu Hình thái tế bào Gram Catalase
1 NFRI 7301 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
2 NFRI 7325 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
3 NFRI 7330 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
4 NFRI 7327 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
5 NFRI 7328 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
6 NFRI 7333 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
7 NFRI 7339 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
8 T51 Pho mát Trực khuẩn + -
9 T53 Pho mát Trực khuẩn + -
10 T54 Pho mát Trực khuẩn + -
11 T55 Pho mát Trực khuẩn + -
12 CNTP6523 Sữa chua Trực khuẩn + -
13 CNTP6524 Sữa chua Trực khuẩn + -
14 CNTP6525 Sữa chua Trực khuẩn + -
15 ASNFOS1 Sữa chua uống Trực khuẩn + -
16 LD3 Dưa chua Trực khuẩn + -
17 SNC2 Sữa chua Trực khuẩn + -
18 SD1 Sữa mẹ Trực khuẩn + -
19 YAK Sữa chua uống Trực khuẩn + -
20 NFRI 7101 Chủng trao đổi Cầu khuẩn, chuỗi dài + - 21 NFRI 7423 Chủng trao đổi Cầu khuẩn, chuỗi dài + - 22 NFRI 7431 Chủng trao đổi Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
43 STT Ký hiệu
chủng Nguồn mẫu Hình thái tế bào Gram Catalase
23 VNC1 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
24 VNC2 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
25 VNC3 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
26 MCK1 Sữa chua Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
27 MCK2 Sữa chua Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
28 M11 Pho mát Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
29 M32 Pho mát Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
30 AABT51 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + - 31 AABY101 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
32 SBV3 Sữa chua Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
33 SN2 Sữa chua uống Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
34 AS 62 Sữa mẹ Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
35 BAC30 Nem chua Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
36 IFO 12964 Chủng trao đổi Cầu khuẩn, chuỗi dài + - 37 JNFOS3 Nước hoa quả
lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
38 T21 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
Các chủng vi khuẩn lactic này được khảo sát, sàng lọc theo các tiêu chí phù hợp làm giống khởi động như: sinh axit, đông tụ sữa nhanh, tổng hợp exopolysaccharide, X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase, ảnh hưởng tích cực tới sự tạo thành các hợp chất hương. Kết quả thể hiện ở các nghiên cứu tiếp theo: 3.1.1. Khả năng đông tụ sữa
Lên men đường tạo axit lactic là một trong những chức năng chính của các chủng khởi động sử dụng trong sản xuất pho mát. Kết quả của quá trình axit hóa này là tạo ra quện sữa đông – là nguyên liệu cho sản xuất pho mát. Kiểm tra khả năng đông tụ sữa của 38 chủng vi khuẩn lactic trên. Sinh khối của mỗi chủng lấy từ đĩa thạch nuôi ở 30oC, sau 48 giờ được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường litmus – lactose. Kết quả được thể hiện ở bảng dưới:
44
Bảng 3.2: Khả năng đông tụ sữa của vi khuẩn lactic STT Kí hiệu chủng Khả năng đông tụ sữa STT Kí hiệu chủng Khả năng đông tụ sữa 1 NFRI 7301 +/- 20 NFRI 7101 - 2 NFRI 7325 + 21 NFRI 7423 +/- 3 NFRI 7330 + 22 NFRI 7431 -/+ 4 NFRI 7327 + 23 VNC1 ++ 5 NFRI 7328 -/+ 24 VNC2 ++ 6 NFRI 7333 + 25 VNC3 ++ 7 NFRI 7339 -/+ 26 MCK1 ++ 8 T51 ++ 27 MCK2 - 9 T53 +/- 28 M11 ++ 10 T54 - 29 M32 ++ 11 T55 +/- 30 AABT51 -/+ 12 CNTP6523 + 31 AABY101 +/- 13 CNTP6524 + 32 SBV3 -/+ 14 CNTP6525 + 33 SN2 - 15 ASNFOS1 + 34 AS 62 +/- 16 LD3 - 35 BAC30 -/+ 17 SNC2 - 36 IFO 12964 + 18 SD1 +/- 37 JNFOS3 + 19 YAK ++ 38 T21 ++
Ký hiệu: Khả năng đông tụ sữa chia làm 5 mức:
++ Đông tụ nhanh, (1 ngày) -/+ Đông tụ rất yếu, (5 -7 ngày)
+ Đông tụ, (2 - 3 ngày) - Sau 7 ngày không có hiện tượng đông tụ
+/- Đông tụ yếu, (3 - 5 ngày)
Theo bảng trên, trong số 38 chủng được khảo sát thì có 9 chủng có khả năng đông tụ sữa nhanh (trong thời gian 24 giờ), 10 chủng làm đông tụ sữa sau 2 – 3 ngày, 7 chủng đông tụ sữa yếu, 6 chủng gây đông tụ ở mức rất yếu và 6 chủng sau 7 ngày vẫn chưa có hiện tượng đông tụ sữa.
45
VNC1 và T21 Đối chứng
Hình 3.1: Khả năng đông tụ sữa của VNC1 và T21 sau 24 giờ
Từ kết quả trên, lựa chọn những chủng có khả năng đông tụ sữa nhanh để khảo sát các đặc điểm tiếp theo. 9 chủng được lựa chọn gồm: M11, VNC1, VNC2, VNC3, M32, YAK, T21, T51, MCK1.
3.1.2. Phổ nhiệt độ sinh trưởng
Trong sản xuất pho mát cũng như lên men thu sinh khối, nhiệt độ là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất của quá trình và cần được tối ưu hóa. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của 9 chủng trên. Các chủng được cấy trên đĩa thạch, nuôi ở dải nhiệt độ khác nhau. Khả năng thích nghi với nhiệt độ của mỗi chủng được đánh giá dựa vào kích thước khuẩn lạc trên đĩa thạch sau 48h nuôi cấy. Kết quả thể hiện ở bảng dưới:
46
Bảng 3.3: Dải nhiệt độ sinh trưởng của các vi khuẩn lactic
STT Chủng (kí hiệu) 15 o C 20oC 30oC 37oC 40oC 42oC 45oC 1 M11 -/+ -/+ + + - - - 2 VNC1 -/+ -/+ + + -/+ - - 3 VNC2 -/+ -/+ + + -/+ - - 4 VNC3 -/+ -/+ + + -/+ - - 5 YAK - -/+ + + -/+ - - 6 T21 - - + + + + -/+ 7 MCK1 - - + + -/+ - - 8 T51 - - + + + + -/+ 9 M32 -/+ -/+ + + -/+ - -
Ký hiệu: (+) khuẩn lạc mọc tốt, (-) khuẩn lạc không mọc, (-/+) khuẩn lạc mọc ít.
Như vậy, qua đánh giá sơ bộ khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau của các chủng cho thấy, 2 chủng T21 và T51 là chủng ưa nhiệt, có khả năng phát triển ở dải nhiệt độ 30 – 45oC. Bảy chủng còn lại là những chủng ưa ấm có phổ nhiệt độ sinh trưởng 15 – 40oC (ngoại trừ chủng YAK, MCK1 và M11 không sinh trưởng ở các nhiệt độ tương ứng là 15oC, 15 – 20oC và 40oC). Các thí nghiệm về sau, tiến hành nuôi cấy ở 30oC đối với các chủng ưa ấm và 37oC với các chủng ưa nhiệt.
3.1.3. Kiểu lên men lactic
Khảo sát quá trình lên men lactic đồng hình, dị hình của các LAB dựa trên khả năng sinh khí CO2 khi nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng. Kết quả thể hiện ở bảng dưới:
47
Bảng 3.4: Kiểu lên men lactic của các vi khuẩn lactic STT Chủng(kí hiệu) Khả năng sinh CO2
1 M11 - 2 VNC1 - 3 T21 - 4 MKC1 - 5 T51 - 6 M32 - 7 VNC2 - 8 YAK - 9 VNC3 -
* Ký hiệu (-) Lên men lactic đồng hình; (+) Lên men lactic dị hình
Kết quả bảng 3.4 cho thấy, 9 chủng đều có quá trình lên men lactic đồng hình. Trong công nghệ sản xuất chủng giống khởi động, các chủng lên men lactic dị hình hiếm khi được sử dụng như là giống khởi động do làm giảm hiệu suất của quá trình đông tụ sữa. Hơn nữa, khi mật độ quá cao, sự sinh khí CO2 sẽ gây hiện tượng vỡ, nứt pho mát và tạo ra sự cồng kềnh khi đóng gói và vận chuyển sản phẩm.
3.1.4. Khả năng chuyển hóa citrate
Trong sản xuất pho mát không có quá trình ủ chín sinh hóa thì các chủng có khả năng chuyển hóa được citrate, được sử dụng với mục đích chính là tạo hương cho sản phẩm. Kết quả của quá trình này là hình thành các hợp chất tạo hương như diacetyl, acetate, acetoin. Do đó, chúng tôi khảo sát khả năng chuyển hóa citrate của các chủng LAB. Khuẩn lạc của 9 chủng, lấy từ đĩa MRS – agar đã nuôi 48 giờ, được cấy ria sang đĩa chứa môi trường thử citrate. Kiểm tra sự tạo màu xanh Prussian trên đĩa sau 48 giờ nuôi ở nhiệt độ thích hợp. Kết quả như sau:
48
Bảng 3.5: Khả năng chuyển hóa citrate của các vi khuẩn lactic STT Chủng (kí hiệu) Khả năng chuyển hóa citrate
1 M11 + 2 VNC3 + 3 T51 - 4 YAK + 5 MCK1 - 6 VNC1 + 7 VNC2 + 8 M32 + 9 T21 -
Kí hiệu: (+) Có màu xanh Prussian - Sử dụng được citrate, (- )Không xuất hiện màu xanh - không sử dụng được citrate
Kết quả bảng trên cho thấy, trong số 9 chủng khảo sát thì có 6 chủng: M11, M32, VNC1, VNC2, VNC3, YAK có khả năng chuyển hóa được citrate.
Hình 3.2: Khả năng sử dụng citrate
Ở các chủng thuộc chi Lactococcus, khả năng chuyển citrate thuộc về Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis và Leuconostoc spp. Kết quả nghiên cứu về sử dụng citrate của các loài Lactobacillus thường khác nhau: Chủng Lb.rhamnosus
VNC1 VNC3 M32 VNC2 M11 T51 T21
49
ATCC 7469 có thể sử dụng citrate làm nguồn năng lượng khi nguồn glucose bị cạn kiệt [20]. Ngược lại, kết quả nghiên cứu của Cogan et al. (1998) cho thấy các chủng
Lb. casei ATCC 393 và Lb. plantarum 1919 không sử dụng citrate làm nguồn năng
lượng, nhưng citrate có thể được đồng chuyển hóa khi có mặt của glucose hoặc galactose [57].
3.1.5. Khả năng tổng hợp exopolysaccharide
Khảo sát khả năng tổng hợp exopolysaccharide của 9 chủng LAB. Phương
pháp thực hiện như (2.4.5). Kết quả thể hiện ở bảng dưới:
Bảng 3.6: Hàm lượng exopolysaccharide được tổng hợp bởi các vi khuẩn lactic
STT Chủng
(kí hiệu)
Lượng EPS trong sữa lên men bởi từng
chủng Lượng exopolysaccharide tổng hợp, mg/l 1 VNC2 144,14 - 154,16 68,00 ± 5,06 2 T51 122,53 - 124,24 49,90 ± 0,50 3 VNC3 146,7 - 157,18 67,41 ± 5,26 4 MCK1 176,56 - 183,92 95,73 ± 3,79 5 T21 116,08 - 119,73 35,43 ± 1,94 6 M11 132,72 - 135,48 52,51 ± 1,95 7 VNC1 144,91 - 153,22 70,46 ± 5,87 8 YAK 149,2 - 152,53 89,15 ± 2,35 9 M32 136,34 - 138,58 65,59 ± 2,04 10 ĐC 61,72 - 84,51
Kết quả bảng 3.6 cho thấy, hàm lượng EPS được tổng hợp dao động trong khoảng 35,43 – 95,73 mg/l, trong đó chủng MCK1 tổng hợp EPS với hàm lượng cao nhất 95,73 mg/l. Nồng độ này thấp hơn nhiều so với lượng EPS được các chủng lactic phân lập từ sữa lên men Burkina Faso tổng hợp, trong đó chủng
Streptococcus thermophilus MR10 có hoạt tính tổng hợp EPS cao nhất (814 mg/l), thấp nhất là chủng Lactobacillus acidophilus MR1 (219 mg/l) [13]. Tuy nhiên, kết
50
quả nghiên cứu của Ginka I. Frengova và cộng sự [35] cho thấy, các chủng