Phương pháp này thực hiện theo MAGBOUL và cộng sự (2000) [50], có cải biến. Phương pháp dựa trên hoạt động của enzym PepX, giải phóng ra p – nitroaniline (pNA) từ cơ chất Glycyl – prolyl – 4 – nitroanilide (Gly – Pro – pNA). Lượng pNA giải phóng ra quy định hoạt tính của enzym PepX. Các bước tiến hành như sau:
Chuẩn bị dịch chiết enzym nội bào
Chủng vi khuẩn được nuôi trong 200 ml môi trường MRS ở 30oC với các chủng ưa ấm và 37oC với các chủng ưa nhiệt trong thời gian 20 giờ. Tiến hành ly
34
tâm thu sinh khối 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC. Sinh khối được rửa 2 lần bằng 50 ml nước muối 0,85%, pH 7. Sinh khối thu được bằng cách ly 8000 vòng/ phút trong 15 phút, ở 4oC. Sau rửa, sinh khối được tái huyền phù trong 20 ml đệm Tris HCl 0,05 M, pH 7,4 vô trùng (thể tích đệm Tris HCl bằng 1/10 thể tích dịch nuôi cấy). Tiến hành phá tế bào bằng máy French press, áp lực 2100 psi. Điều chỉnh van đóng/mở sao cho dịch chảy ra không quá 15 giọt/phút. Sau khi phá tế bào, dịch được ly tâm 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch trong, phân phối vào các ống eppendoff vô trùng, và bảo quản ở tủ đá (- 20oC) cho đến khi phân tích.
Kiểm tra sơ bộ hoạt tính PepX
Phân phối 50 µl cơ chất Glycyl – prolyl – p – nitroanilide (Gly – Pro – pNA) 2,0 mM vào các giếng trên đĩa Elisa. Bổ sung 50 µl dịch chiết nội bào của mỗi chủng vào mỗi giếng đã có cơ chất. Đối chứng (-): Thay dịch chiết nội bào bằng 50 ul đệm Tris HCl vô trùng. Đối chứng (+): 50 ul dịch chiết nội bào của chủng PK2 (chủng đã biết có hoạt tính PepX). Hỗn hợp để ở tủ 37oC và quan sát màu sau 5, 15, 30, 60, 90, 120 phút. Nếu có xuất hiện màu vàng sẽ được ghi nhận là có hoạt tính enzyme (+). Sau 120 phút nếu không xuất hiện màu vàng sẽ ghi nhận là không có hoạt tính (-).
Xác định hoạt tính PepX
- Dung dịch đường chuẩn pNA có dải nồng độ: 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mM.
- Để xác định nồng độ pNA giải phóng ra, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau: OD1: 50 µl dịch cơ chất + 50 µl dịch nội bào.
OD2: 50 µl dịch cơ chất + 50 µl đệm Tris HCl. OD3: 50 µl dịch nội bào + 50 µl đệm Tris HCl.
Hỗn hợp được để ở 37oC. Khi nào xuất hiện màu vàng (căn cứ theo thời gian ở bước kiểm tra sơ bộ), thì tiến hành đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 405 nm.
Mật độ quang của pNA giải phóng ra được tính theo công thức sau: OD (pNA) = OD1 – OD2 – OD3.
Lượng pNA được tính căn cứ vào đường chuẩn và giá trị OD (pNA). Một đơn vị hoạt độ PepX (U) được xác định bằng lượng enzym cần thiết để giải phóng 1
35
nanomol p – nitroaniline sau 1 phút trong điều kiện phản ứng. Hoạt độ riêng của PepX được xác định bằng đơn vị (U)/mg protein.