Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng – protein khử hỗn hợp photphomolipden với photphovonphramat (thuốc thử folin ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng λ = 660nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Hoá chất
Dung dịch protein chuẩn : dung dịch Bovine serum albumin (BSA) Dung dịch 1: Dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N
Dung dịch 2: Dung dịch CuSO4 1%
Dung dịch 3:Dung dịch muối seignett 2% (C4H4KNaO6)
Dung dịch 4: Dung dịch folin chuẩn được pha với nước cất theo tỷ lệ 1 :1 Pha dung dịch mix : dung dịch mix là hỗn hợp của dung dịch 1, dung dịch 2 và dung dịch 3 theo tỷ lệ 100 :1 :1.
Tiến hành
Dựng đường chuẩn BSA theo các dải nồng độ khác nhau từ 0 – 1,0 g/l. Các mẫu đem xác định hàm lượng protein cũng được pha loãng theo các dải nồng độ sao cho giá trị OD nằm trong khoảng giữa của đường chuẩn BSA.
Hút 4ml dung dịch mix vào mỗi ống eppendorf, sau đó bổ sung thêm 0,4 ml dung dịch protein vào ống, vortex và để trong tủ 30oC trong thời gian 10 phút. Sau 10 phút ta thực hiện bổ sung thêm 0,4ml dung dịch 4 (dung dịch folin), lắc đều và để trong tủ 30oC trong thời gian 30 phút. Kết thúc phản ứng ta thực hiện đo OD ở bước sóng λ = 660nm.
Dựa vào giá trị OD thu được ta lập đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa BSA và mật độ quang tại bước sóng λ = 660nm. Ta dựng được đường cong chuẩn BSA là một đường thẳng có phương trình dạng:
36
Trong đó: X: giá trị mật độ quang (OD).
Y: hàm lượng protein có trong mẫu (mg/ml).
Dựa vào đường cong chuẩn BSA để xác định hàm lượng protein có trong mẫu. 2.4.11. Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng nguồn cacbon
Phương pháp sử dụng bromocresol purple là chất chỉ thị pH. Khi chủng lactic sử dụng được đường như là nguồn năng lượng sẽ làm giảm pH dịch nuôi cấy. Trong môi trường axit, bromocresol purple sẽ chuyển từ màu tím sang màu vàng. 49 loại đường được thử khả năng sử dụng của chủng lactic là:
Bảng 2.1: Các nguồn cacbon của bộ kit API 50 CHL
STT Đường STT Đường 0 Control 25 Esculin 1 Glycerol 26 Salicin 2 Erythritol 27 Cellobiose 3 D- Arabinose 28 Maltose 4 L- Arabinose 29 Lactose 5 Ribose 30 Melibiose 6 D- Xylose 31 Sucrose 7 L- Xylose 32 Trehalose 8 Adonitol 33 Inulin
9 β Methyl - D- Xyloside 34 Melezitose
10 Galactose 35 Raffinose 11 Glucose 36 Starch 12 Fructose 37 Glycogen 13 Mannose 38 Xylitol 14 Sorbose 39 Gentiobiose 15 Rhamnose 40 D- Turanose 16 Dulcitol 41 D- Lyxose 17 Inositol 42 D- tagatose 18 Mannitol 43 D- Fucose 19 Sorbitol 44 L- Fucose
20 α - Metyl -D-Mannoside 45 D-Arabitol 21 α - Metyl -D-Glucoside 46 L- Arabitol 22 N-Acetyl-Glucosamine 47 Gluconate
23 Amygdalin 48 2-keto- Gluconate
37 Tiến hành
Các thao tác thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit API 50 CHL. Chủng lactic được cấy ria trên đĩa MRS – agar nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong 48h. Sinh khối từ đĩa thạch được tái huyền phù vào lọ API 50 CHL medium của kit, sao cho độ đục đạt tới 2 McFarland. Sau đó, phân phối dịch huyền phù vào các giếng đã có sẵn nguồn cacbon trên khay ủ của kit. Nuôi ở 30oC đối với các chủng ưa ấm và 37oC với chủng ưa nhiệt. Kiểm tra sau 24 và 48 giờ. Loại đường mà chủng lactic sử dụng được sẽ làm bromocresol purple trong giếng chuyển sang màu vàng.
2.4.12. Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzym
Hoạt tính của enzym được thể hiện qua sự phân giải cơ chất tạo thành hợp chất sinh màu khi có mặt đồng thời hai thuốc thử là ZYM A (hỗn hợp gồm: Tris – hydroxymethyl – aminomethane, HCl (37%), sodium lauryl sulfate, nước) và ZYM B (hỗn hợp gồm: Fast Blue BB, methanol, dimethylsulfoxide) của bộ kit API ZYM. 19 enzym được khảo sát:
Bảng 2.2: Enzym và cơ chất của bộ kit API ZYM
STT Enzym Cơ chất
1 Control
2 Alkaline phosphatase 2-naphthyl phosphate 3 Esterase (C4) 2-naphthyl butyrate 4 Esterase lipase (C8) 2-naphthyl caprylate 5 Lipase (C14) 2-naphthyl myristate 6 Leucine arylamidase L-leucyl-2-naphthylamide 7 Valine arylamidase L-valyl-2-naphthylamide 8 Cystine arylamidase L-cystyl-2-naphthylamide
9 Trysin N-benzoyl-DL-arginine-2-
naphthylamide (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10 α – chymotrypsin N-glutaryl-phenylalanine-2- naphthylamide
11 Acid phosphatase 2-naphthyl phosphate 12 Naphthol - AS - BI –
phosphohydrolase Naphthol-AS-BI-phosphate
13 α – galactosidase 6-Br-2-naphthyl-αD-galactopyranoside 14 β – galactosidase 2-naphthyl-βD-galactopyranoside
38
STT Enzym Cơ chất
15 β – glucuronidase Naphthol-AS-BI-βD-glucuronide 16 α – glucosidase 2-naphthyl -αD-glucopyranoside 17 β – glucosidase 6-Br-2-naphthyl-βD-glucopyranoside 18 N – acetyl – β –
glucosaminidase 1-naphthyl-N-acetyl-βD-glucosaminide 19 α – mannosidase 6-Br-2-naphthyl-αD-manopyranoside 20 α – fucosidase 2-naphthyl -αL-fucopyranoside Chuẩn bị dịch mẫu
- Dịch chiết nội bào: Mỗi chủng được nuôi trong môi trường MRS ở nhiệt độ
thích hợp/ 20 giờ. Sau đó, tiến hành phá tế bào để thu dịch nội bào. Các thao tác thực hiện như trong phương pháp phân tích hoạt tính pep X.
- Dịch huyền phù tế bào: Sinh khối của mỗi chủng, lấy từ đĩa thạch đã nuôi
48h, được tái huyền phù trong ống chứa 2 ml nước cất vô trùng sao cho độ đục đạt được là 5 McFarland.
- Dịch chiết ngoại bào: Các chủng lactic được nuôi trong môi trường sữa tươi
đã vô trùng ở 110oC/ 20 phút cho tới khi đông tụ. Sau đó, dịch lên men sữa được ly tâm 10000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC. Phần dịch trong sau ly tâm được lọc qua màng lọc vô khuẩn 0,2 µm. Chỉnh pH của dịch vô trùng này lên pH 7 bằng NaOH 10% lạnh, vô trùng. Tiến hành ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút để thu dịch trong.
Tiến hành
Kiểm tra hoạt tính enzym của dịch chiết nội bào, ngoại bào và dịch huyền phù tế bào của mỗi chủng được tiến hành song song. Các thao tác như theo hướng dẫn của bộ kit: Phân phối 65 µl của mỗi dịch trên vào các giếng, đã có sẵn cơ chất của các enzym tương ứng, của khay ủ. Các khay này được để ở 37oC/ 4 giờ. Sau đó, nhỏ 1 giọt ZYM A vào các giếng trên khay. Nhỏ tiếp 1 giọt ZYM B. Quan sát màu sau 5 phút. Hoạt tính enzym được định tính theo độ đậm, nhạt của màu sắc xuất hiện ở giếng, dựa vào phổ màu của bộ kit để chia theo thang điểm từ 0 – 5. Mẫu đối chứng không có cơ chất.
39
2.4.13. Phương pháp xác định tên loài bằng trình tự 16S rDNA Tách chiết DNA tổng số và PCR Tách chiết DNA tổng số và PCR
Phương pháp tách chiết DNA tổng số được mô tả ngắn gọn như sau: Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 5000 x g trong 10 phút, thu sinh khối, hòa tan sinh khối trong 0,5 ml đệm (Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS). Ủ phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Bổ sung 0,15 ml CH3COOK. Ly tâm 10000 x g trọng lượng tương đương isopropanol. Ly tâm ở 13000 x g trong 10 phút ở 4oC thu tủa. Rửa tủa bằng ethanol 70%. Làm khô tủa, hòa tan lại DNA với 50ul nước deion vô trùng.
Khuếch đại gen mã hóa 16S rRNA
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu: 27F (5' – AGAGTTTGATCMTGGCTCAG – 3') và 1492R (5' – TACGGYTACCTTGTTACGACTT – 3').
Thành phần PCR:
+ 5 mM dNTPs (Fermentas) : 1,5 µl + 10X Taq Buffer (Sigma) : 2,5 µl + 5 µM 27F (mồi xuôi) : 1 µl +5 µM 1492R (mồi ngược) : 1µl
+ DNA template : 1 µl
+ Taq DNA pol (Sigma) : 0,5 µl
+ H2O : 17,5
Tổng thể tích phản ứng : 25 µl
Chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 95oC trong 5 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (94oC trong 45 giây, 52oC trong 60 giây và 72oC trong 1 phút 30 giây). Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 72oC trong 5 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 10oC.
Sản phẩm PCR được tinh sạch và xác định trình tự tại hãng Macrogen Inc, Hàn Quốc. Kết quả trình tự được sử dụng để Blast lên ngân hàng dữ liệu Genbank NCBI, cho phép nhận diện loài trong mẫu nghiên cứu dựa vào độ tương đồng trong cấu trúc trình tự 16S rDNA.
40 2.4.14. Phương pháp sản xuất pho mát tươi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thu sinh khối chủng giống
Chủng giống được nuôi trong bình tam giác, chứa 100 ml môi trường MRS, ở nhiệt độ thích hợp với từng chủng. Sau 20 giờ, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 30oC, thu sinh khối. Sinh khối được rửa bằng nước muối 0,85%, pH 7. Tiến hành ly tâm lần 2, 8000 vòng/ phút trong 5 phút ở 30oC. Sinh khối thu được được hòa với 20 ml sữa đã tiệt trùng. Lượng sinh khối này dùng để lên men 1 lít sữa.
Quy trình làm pho mát
Trong khuôn khổ của đề tài, chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn, được ứng dụng để thử nghiệm sản xuất loại pho mát tươi, không bổ sung rennet. Thực hiện theo mô tả của Ricki Carroll (2002) [67], có cải biến:
1. Sữa thanh trùng Mộc Châu đã được tiệt trùng 110oC/ 20 phút, được làm nguội xuống 30oC.
2. Cấy chủng giống vào sữa. 3. Ủ 30oC cho đến khi đông tụ.
4. Cắt quện sữa thành các ô vuông, kích thước 0,5 - 1 cm. Để yên 10 phút. 5. Gia nhiệt bằng phương pháp cách thủy sữa đông, tăng nhiệt từ 30 đến 45oC trong thời gian 40 phút (tốc độ tăng nhiệt 0,5oC/ 1phút).
6. Tách nước.
7. Treo quện sữa 14 giờ ở nhiệt độ phòng.
8. Bổ sung muối với lượng 600 mg/ 100g pho mát tươi. 9. Bảo quản tủ lạnh 4 – 6oC. Sử dụng trong 2 tuần.
Trước khi bảo quản, mẫu pho mát được đánh giá hương thơm. Đánh giá hương của pho mát tươi
Khả năng tạo hương của các chủng lactic trên mẫu pho mát được cảm quan theo phương pháp đánh giá mùi. Hội đồng gồm 9 thành viên. Các mẫu được đựng trong lọ thủy tinh (150g/ lọ) có nắp kín. Các thành viên thử bằng cách cảm quan, sau đó viết nhận xét. Sau mỗi lần thử, thành viên nghỉ 5 phút và uống nước trắng.
41
2.4.15. Tách hợp chất dễ bay hơi bằng phương pháp chưng cất
Phương pháp được thực hiện theo Magda. A. Abd El-Mageed (1997) [51], có cải biến.
Các hợp chất hương dễ bay hơi trong pha nước được chưng cất và trích ly sang pha dung môi chứa dietyl ete và n – hexan. 500g hỗn hợp gồm pho mát tươi và phần nước sữa tách ra quá trình sản xuất lượng pho mát trên được đồng nhất và đổ vào bình cầu dung tích 1 lít. Gia nhiệt dịch mẫu tới 100oC. Nước bay hơi, cuốn theo các hợp chất hương qua ống sinh hàn, hơi nước được làm lạnh, chảy xuống cột chứa dung môi dietyl ete : n – hexan (1:1). Tại đây, các cấu tử hương chiết sang pha dung môi, pha nước được hồi lưu vào bình chứa mẫu. Thời gian trích ly 3 giờ. Làm khô phần dung môi thu được bằng Na2SO4 khan và cô đặc ở nhiệt độ phòng. Bổ sung 100 µl dung môi để hòa tan hợp chất hương. Xác định thành phần hỗn hợp bằng thiết bị sắc kí khí khối phổ GC – MS Angilent technologie, chu trình nhiệt: Ban đầu 70oC giữ 5 phút, tăng nhiệt lên 230oC với mức 5oC/phút và giữ ở 230oC trong 5 phút; khối phổ theo phương pháp ion hóa sử dụng dòng electron với năng lượng 70eV, nhiệt độ nguồn ion 200oC.
42
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu đặc điểm của giống khởi động cho sản xuất pho mát
Bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm gồm khoảng 280 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy ở nhiều sản phẩm lên men lactic từ sữa, rau quả, ngũ cốc tới thịt, cá... lên men và một số chủng là trao đổi. Trong khuôn khổ của đề tài, 38 chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc chủ yếu từ sữa, các sản phẩm lên men từ sữa và một số chủng trao đổi được quan tâm nghiên cứu trước tiên. Nguồn phân lập, sưu tập giống của các chủng được thống kê ở bảng 3.1 dưới đây.
Bảng 3.1. Thống kê các chủng vi khuẩn lactic được khảo sát STT Ký hiệu
chủng Nguồn mẫu Hình thái tế bào Gram Catalase
1 NFRI 7301 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
2 NFRI 7325 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
3 NFRI 7330 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
4 NFRI 7327 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
5 NFRI 7328 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
6 NFRI 7333 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
7 NFRI 7339 Chủng trao đổi Trực khuẩn + -
8 T51 Pho mát Trực khuẩn + - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9 T53 Pho mát Trực khuẩn + -
10 T54 Pho mát Trực khuẩn + -
11 T55 Pho mát Trực khuẩn + -
12 CNTP6523 Sữa chua Trực khuẩn + -
13 CNTP6524 Sữa chua Trực khuẩn + -
14 CNTP6525 Sữa chua Trực khuẩn + -
15 ASNFOS1 Sữa chua uống Trực khuẩn + -
16 LD3 Dưa chua Trực khuẩn + -
17 SNC2 Sữa chua Trực khuẩn + -
18 SD1 Sữa mẹ Trực khuẩn + -
19 YAK Sữa chua uống Trực khuẩn + -
20 NFRI 7101 Chủng trao đổi Cầu khuẩn, chuỗi dài + - 21 NFRI 7423 Chủng trao đổi Cầu khuẩn, chuỗi dài + - 22 NFRI 7431 Chủng trao đổi Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
43 STT Ký hiệu
chủng Nguồn mẫu Hình thái tế bào Gram Catalase
23 VNC1 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
24 VNC2 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
25 VNC3 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
26 MCK1 Sữa chua Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
27 MCK2 Sữa chua Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
28 M11 Pho mát Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
29 M32 Pho mát Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
30 AABT51 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + - 31 AABY101 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
32 SBV3 Sữa chua Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
33 SN2 Sữa chua uống Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
34 AS 62 Sữa mẹ Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
35 BAC30 Nem chua Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
36 IFO 12964 Chủng trao đổi Cầu khuẩn, chuỗi dài + - 37 JNFOS3 Nước hoa quả
lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
38 T21 Sữa lên men Cầu khuẩn, chuỗi dài + -
Các chủng vi khuẩn lactic này được khảo sát, sàng lọc theo các tiêu chí phù hợp làm giống khởi động như: sinh axit, đông tụ sữa nhanh, tổng hợp exopolysaccharide, X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase, ảnh hưởng tích cực tới sự tạo thành các hợp chất hương. Kết quả thể hiện ở các nghiên cứu tiếp theo: 3.1.1. Khả năng đông tụ sữa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lên men đường tạo axit lactic là một trong những chức năng chính của các chủng khởi động sử dụng trong sản xuất pho mát. Kết quả của quá trình axit hóa này là tạo ra quện sữa đông – là nguyên liệu cho sản xuất pho mát. Kiểm tra khả năng đông tụ sữa của 38 chủng vi khuẩn lactic trên. Sinh khối của mỗi chủng lấy từ đĩa thạch nuôi ở 30oC, sau 48 giờ được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường litmus – lactose. Kết quả được thể hiện ở bảng dưới:
44
Bảng 3.2: Khả năng đông tụ sữa của vi khuẩn lactic STT Kí hiệu chủng Khả năng đông tụ sữa STT Kí hiệu chủng Khả năng đông tụ sữa 1 NFRI 7301 +/- 20 NFRI 7101 - 2 NFRI 7325 + 21 NFRI 7423 +/- 3 NFRI 7330 + 22 NFRI 7431 -/+ 4 NFRI 7327 + 23 VNC1 ++ 5 NFRI 7328 -/+ 24 VNC2 ++ 6 NFRI 7333 + 25 VNC3 ++ 7 NFRI 7339 -/+ 26 MCK1 ++ 8 T51 ++ 27 MCK2 - 9 T53 +/- 28 M11 ++ 10 T54 - 29 M32 ++ 11 T55 +/- 30 AABT51 -/+ 12 CNTP6523 + 31 AABY101 +/- 13 CNTP6524 + 32 SBV3 -/+ 14 CNTP6525 + 33 SN2 - 15 ASNFOS1 + 34 AS 62 +/- 16 LD3 - 35 BAC30 -/+