Hoạt tính của enzym được thể hiện qua sự phân giải cơ chất tạo thành hợp chất sinh màu khi có mặt đồng thời hai thuốc thử là ZYM A (hỗn hợp gồm: Tris – hydroxymethyl – aminomethane, HCl (37%), sodium lauryl sulfate, nước) và ZYM B (hỗn hợp gồm: Fast Blue BB, methanol, dimethylsulfoxide) của bộ kit API ZYM. 19 enzym được khảo sát:
Bảng 2.2: Enzym và cơ chất của bộ kit API ZYM
STT Enzym Cơ chất
1 Control
2 Alkaline phosphatase 2-naphthyl phosphate 3 Esterase (C4) 2-naphthyl butyrate 4 Esterase lipase (C8) 2-naphthyl caprylate 5 Lipase (C14) 2-naphthyl myristate 6 Leucine arylamidase L-leucyl-2-naphthylamide 7 Valine arylamidase L-valyl-2-naphthylamide 8 Cystine arylamidase L-cystyl-2-naphthylamide
9 Trysin N-benzoyl-DL-arginine-2-
naphthylamide
10 α – chymotrypsin N-glutaryl-phenylalanine-2- naphthylamide
11 Acid phosphatase 2-naphthyl phosphate 12 Naphthol - AS - BI –
phosphohydrolase Naphthol-AS-BI-phosphate
13 α – galactosidase 6-Br-2-naphthyl-αD-galactopyranoside 14 β – galactosidase 2-naphthyl-βD-galactopyranoside
38
STT Enzym Cơ chất
15 β – glucuronidase Naphthol-AS-BI-βD-glucuronide 16 α – glucosidase 2-naphthyl -αD-glucopyranoside 17 β – glucosidase 6-Br-2-naphthyl-βD-glucopyranoside 18 N – acetyl – β –
glucosaminidase 1-naphthyl-N-acetyl-βD-glucosaminide 19 α – mannosidase 6-Br-2-naphthyl-αD-manopyranoside 20 α – fucosidase 2-naphthyl -αL-fucopyranoside Chuẩn bị dịch mẫu
- Dịch chiết nội bào: Mỗi chủng được nuôi trong môi trường MRS ở nhiệt độ
thích hợp/ 20 giờ. Sau đó, tiến hành phá tế bào để thu dịch nội bào. Các thao tác thực hiện như trong phương pháp phân tích hoạt tính pep X.
- Dịch huyền phù tế bào: Sinh khối của mỗi chủng, lấy từ đĩa thạch đã nuôi
48h, được tái huyền phù trong ống chứa 2 ml nước cất vô trùng sao cho độ đục đạt được là 5 McFarland.
- Dịch chiết ngoại bào: Các chủng lactic được nuôi trong môi trường sữa tươi
đã vô trùng ở 110oC/ 20 phút cho tới khi đông tụ. Sau đó, dịch lên men sữa được ly tâm 10000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC. Phần dịch trong sau ly tâm được lọc qua màng lọc vô khuẩn 0,2 µm. Chỉnh pH của dịch vô trùng này lên pH 7 bằng NaOH 10% lạnh, vô trùng. Tiến hành ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút để thu dịch trong.
Tiến hành
Kiểm tra hoạt tính enzym của dịch chiết nội bào, ngoại bào và dịch huyền phù tế bào của mỗi chủng được tiến hành song song. Các thao tác như theo hướng dẫn của bộ kit: Phân phối 65 µl của mỗi dịch trên vào các giếng, đã có sẵn cơ chất của các enzym tương ứng, của khay ủ. Các khay này được để ở 37oC/ 4 giờ. Sau đó, nhỏ 1 giọt ZYM A vào các giếng trên khay. Nhỏ tiếp 1 giọt ZYM B. Quan sát màu sau 5 phút. Hoạt tính enzym được định tính theo độ đậm, nhạt của màu sắc xuất hiện ở giếng, dựa vào phổ màu của bộ kit để chia theo thang điểm từ 0 – 5. Mẫu đối chứng không có cơ chất.
39