Phương pháp này dựa trên khả năng không tan trong ethanol và tan trong nước nóng của exopolysaccharide. Lượng EPS thu được sẽ được định lượng theo phương
31
pháp phân tích đường tổng phenol - axit sunfuric, sử dụng glucose là chất chuẩn. Tiến hành theo mô tả của Pablo Sebastián RIMADA và cộng sự (2003) [56]:
Chủng vi khuẩn, được hoạt hóa hai lần trong ống nghiệm chứa 5 ml môi trường MRS, nuôi ở 30oC (chủng ưa ấm) và 37oC (chủng ưa nhiệt)/ 18 giờ. Sau đó, 5ml dịch nuôi cấy được ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 30oC. Sinh khối thu được, dùng để lên men 50 ml sữa thanh trùng Mộc Châu đã được hấp tiệt trùng 110oC/ 20 phút. Mẫu đối chứng không bổ sung vi sinh vật. Sau đông tụ, dịch sữa lên men và mẫu đối chứng đã chỉnh pH xuống 4,3 bằng HCl 10%, được phá đông tụ và đun cách thủy 15 phút. Ly tâm lần 1: 10000 vòng/ phút trong 15 phút, thu dịch trong. Hút 10 ml dịch trên sang ống fancol, bổ sung 20 ml cồn lạnh và để ở -20oC/ 20 – 24 giờ, làm kết tủa EPS. Ly tâm lần 2, 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu kết tủa. Hòa tan phần kết tủa thu được trong 10 ml nước nóng (> 95oC) và để nguội. Bổ sung 20 ml cồn lạnh, để -20oC/ 20 – 24 giờ. Ly tâm lần 3, 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu kết tủa. Kết tủa được hòa tan với 10 ml nước nóng. Tiến hành ly tâm lần 4, 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 30oC, thu dịch trong. Dịch này dùng để xác định hàm lượng EPS trong dịch sữa lên men, được bảo quản ở -20oC cho tới khi phân tích.
2.4.6. Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số phenol - axit sunfuric Axit H2SO4 đặc có tác dụng phân cắt đường có phân tử lớn thành đường