TÀI LIỆU THAM KHẢO
B.9 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí (phương pháp cấy trang)
Nguyên lý
Vi khuẩn hiếu khí là những vi sinh vật phát triển được trong điều kiện hiếu khí trên môi trường dinh dưỡng không chọn lọc.
Nguyên tắc tiến hành
Đổ 15÷20 ml môi trường nuôi cấy vào đĩa petri đã vô trùng, để yên trong tủ cấy, bật UV tiệt trùng và chờ cho môi trường đặc (khoảng 15÷20 phút). Sau đó, dùng pipet và đầu típ vô trùng, hút 0,1 ml dịch mẫu cho vào các đĩa petri đã chứa môi trường thạch đông đặc. Dùng que cấy trang đều vi sinh vật trên bề mặt đĩa, đem ủ đĩa dưới điều kiện thích hợp.
Phương pháp tiến hành
Cân 10g mẫu, sau đó đem lượng mẫu này nghiền bằng cối sứ và pha vào 90ml dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0.9%). Lúc này ta được dung dịch có nồng độ 10-1.
Hút 1 ml từ dung dịch có nồng độ 10-1, cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch nước muối sinh lý, ta được dung dịch có nồng độ 10-2.
Hút 1 ml từ dung dịch có nồng độ 10-2, cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch nước muối sinh lý, ta được dung dịch có nồng độ 10-3.
Tiếp tục pha loãng mẫu thành các nồng độ khác nhau tùy theo lượng vi sinh có trong mẫu.
Lưu ý rằng các dụng cụ như đầu co hút mẫu, đĩa petri, các ống nghiệm, bình tam giác chứa nước muối sinh lý đều được tiệt trùng (giữ nhiệt 121oC trong 15 phút) cùng với môi trường nuôi cấy sử dụng (môi trường Plate Count Agar (PCA)).
Sau khi kết thúc tiến trình tiệt trùng, tiến hành đổ môi trường PCA trong tủ cấy vào đĩa petri đã vô trùng (khoảng 15÷20 ml môi trường cho 1 đĩa). Để yên các đĩa này trong tủ cấy, bật UV, chờ khoảng 15÷20 phút cho môi trường đông đặt.
Tương ứng với mỗi nồng độ pha loãng, dùng pipette vô trùng cho 1ml mẫu vào đĩa petri này, dùng que cấy trang (đã vô trùng bằng cách nhúng cồn và đốt trên ngọn lửa đèn cồn) để trang đều vi sinh vật trên bề mặt đĩa. Sau đó, đem các đĩa ủ ở 370C trong 24 giờ.
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri ở 2 nồng độ kế tiếp nhau (chọn đĩa petri ở nồng độ sao cho có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 30 < x < 300).
Cách tính kết quả
Gọi N là số khuẩn lạc có trong 1g mẫu được tính theo công thức:
dn n n C N ) 1 . 0 ( 1 + 2 ∑ = Trong đó:
ΣC: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri.
d: Nồng độ pha loãng mẫu mà ở đó đĩa petri đầu tiên được chọn để đếm có số khuẩn lạc thỏa điều kiện 30 < x < 300.
n1: Số đĩa chọn đếm các khuẩn lạc ở nồng độ đầu tiên (n1 = 1 hoặc n1 = 2). n2: Số đĩa chọn đếm các khuẩn lạc ở nồng độ kế tiếp (n2 = 1 hoặc n2 = 2).
Làm tròn số và biểu thị kết quả với 2 số có nghĩa trong khoảng 0.1 đến 9.9 và nhân với 10n (n là bậc lũy thừa cơ số 10).