TÀI LIỆU THAM KHẢO
B.7 Xác định đạm tổng số (phương pháp Kjeldahl)
Nguyên tắc
Ở nhiệt độ cao, dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc và có chất xúc tác, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa, carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O, còn gốc amin thì bị oxy hóa và giải phóng ra NH3, NH3 tác dụng với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Đây là giai đoạn công phá đạm trong mẫu.
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
Trong quá trình chưng cất, (NH4)2SO4 tác dụng với NaOH dư và giải phóng ra NH3:
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2 H2O
Amoniac sinh ra sẽ được hấp thụ bằng dung dịch axit boric tạo thành tetraborat amon. Sau đó chuẩn độ dung dịch tetraborat amon bằng dung dịch chuẩn H2SO4, NH3 được giải phóng và xác định được lượng nitơ, theo các phản ứng sau:
NH3 + H2O → NH4OH
2NH4OH + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 7H2O
(NH4)2B4O7 + H2SO4 +5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO3
Tính được % Nitơ có trong mẫu nhân với 6,25 sẽ suy ra được % protein thô. Chỉ số này tùy thuộc vào tỉ lệ của các hợp chất Nitơ có trong protein, nói cách khác tùy thuộc vào nguồn gốc của protein. Tuy nhiên, người ta thường dùng chỉ số chung là 6,25.
Dụng cụ và hóa chất
- Bộ máy phân tích Kjeldal - Bình chuẩn độ
- Bình tam giác -Cân phân tích - Cốc thủy tinh
- H2O2, H2SO4 đậm đặc,...
Dung dịch H2SO4 0,1N: Pha 1 ống chuẩn H2SO4 với nước cất thành 1lít trong bình định mức.
Dung dịch NaOH 40%: Pha 1000g NaOH tinh thể với nước cất thành 2.5 lít dung dịch.
Dung dịch axit boric: Pha hỗn hợp: 20g axit boric khan + 0,0065g Bromocresol green + 0,013g Metyl red với nước cất thành 1 lít dung dịch. Sau đó đem hỗn hộp khuấy bằng máy khuấy từ trong 24 giờ. Sau 24 giờ mới được sử dụng.
Các bước tiến hành
Công phá đạm
1. Đồng hóa mẫu bằng cối sứ. Cân 0,2 đến 0,25g mẫu trên giấy nhôm sau đó cho vào ống nghiệm Kjeldal, đặt ống vào trong kệ nhôm.
2. Cho vào ống lần lượt 10 ml H2O2 và 10 ml H2SO4 đậm đặc, để yên 5 phút.
3. Đặt cả kệ nhôm vào trong bộ phận công phá đạm. Mở vòi nước và bật máy. * Chỉnh nhiệt độ ở 4 mức 110OC trong 20 phút 200OC trong 20 phút 300OC trong 20 phút 370OC trong 20 phút
Tắt máy, khoảng 30 phút sau, tắt nước, lấy kệ đỡ ra và chờ nguội hẳn. Nếu dung dịch trong ống nghiệm trong suốt là quá trình công phá đạm xảy ra hoàn toàn, nếu còn màu vàng hay nâu thì thêm 5 ml H2O2 và lặp lại bước 3. Chưng cất
Bật máy, kiểm tra NaOH, nước cất trước khi chưng cất.
Đặt ống nghiệm chứa dung dịch đã công phá đạm (NH4)2SO4 vào đúng vị trí ở hệ thống chưng cất đạm.
Bên dưới hệ thống chưng cất, đặt bình tam giác chứa 10 ml dung dịch axit boric 2%.
Xả NaOH từ bình chứa xuống 1 vạch. Đợi khi xuất hiện chữ P thì bấm nút RUN.
Máy chạy khoảng 5 phút, khi xuất hiện chữ “END” thì tắt. Dung dịch trong bình tam giác lúc này có màu hồng hay màu xanh, thông thường là màu xanh.
Chuẩn độ
Cho từng giọt dung dịch H2SO4 0,1N từ ống buret vào bình tam giác và lắc đều, nhẹ đến khi dung dịch vừa chuyển sang màu hồng nhạt thì dừng lại. Ghi thể tích dung dịch H2SO4 0,1N vừa chuẩn độ.
Tính kết quả % N = − 0 ∗0,0014∗100 m ) V (V 116
%CP = %N * 6,25 Trong đó:
%CP: % protein thô
Vo: Thể tích H2SO4 0,1N chuẩn độ mẫu không
V: Thể tích H2SO4 0,1N chuẩn độ mẫu đang phân tích m: Trọng lượng mẫu (g)
0,0014: số g nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N dùng chuẩn độ.