2.3.1. Xác định hàm ẩm
Hàm ẩm của rong mơ được xác định bằng phương pháp sấy khô đến khối
lượng không đổi 11. Phân tích được lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung
bình độ lệch chuẩn.
2.3.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singlton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Tóm tắt: Lấy 0,1 ml dịch chiết rong trộn với 0,9 ml nước cất trước khi thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và
2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được lắc đều rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
trước khi đo bước sóng ở 760 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi mg gallic acid tương đương (GAE)/g chất khô. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là
giá trị trung bình độ lệch chuẩn.
2.3.3. Xác định khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng khử gốc tự do của các mẫu khác nhau (Lee và cộng sự, 2003).
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định dựa theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Lấy 0,3 ml trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3 ml. Sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM (pha trong ethanol 99,5%), lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 517 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia).
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau:
DPPH (%) = 100 × (ACT – ASP)/ACT.
Trong đó:
ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết;
ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết.
Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là thể tích của dịch chiết khử được 50% gốc
tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do
DPPH càng cao. Vì vậy, hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh. Mỗi phân tích được
2.3.4. Xác định tổng năng lực khử
Năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Lấy 1 ml dịch chiết trộn với đệm phosphate pH=6,6 để đạt thể
tích cuối cùng 1,5 ml trước khi thêm 0,5 ml K3(Fe[CN] 6) 1%. Hỗn hợp được ủ ở
50C trong 20 phút, sau đó thêm 0,5 ml TCA 10 % và 2 ml nước cất, cuối cùng 0,4
ml AlCl3 0,1% được thêm vào rồi lắc đều. Độ hấp thu quang học được xác định ở
bước sóng 700 nm. Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh.
Kết quả được báo cáo bởi giá trị IC50, là lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học
lên 0,50. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị
trung bình độ lệch chuẩn.
2.3.5. Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S. mcclurei
trên thịt cá thu bảo quản lạnh
Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S. mcclurei được thử
nghiệm trên thịt cá thu bảo quản lạnh bằng cách xác định chỉ số TBARS (các chất phản ứng với acid Thiobarbituric). Phân tích TBARS đã được đề nghị cách đây hơn 40 năm và hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến để xác định sự oxy hóa lipid. Phương pháp đo Malonaldehyde (MDA) này được hình thành như sản phẩm tách ra của một endoperoxide của các acid béo không bão hòa từ sự oxy hóa lipid. Nó là tiền đề hình thành MDA từ các acid béo. MDA được phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) hình thành chất có màu hồng (TBARS) được đo quang phổ
hấp thụ ở bước sóng 532-535nm 49.
Các chất phản ứng với TBA được xác định theo phương pháp của Lemon (1957) với một sự hiệu chỉnh nhỏ. Tóm tắt: Khoảng 2 g thịt cá thu đã được xay nhuyễn trộn với 10 ml dung dịch chiết TCA 7,5% và tiến hành chiết trong thời gian 10 phút, sau đó lọc qua giấy lọc Whatman No.40. Phần dịch lọc thu được trộn với dung dịch TBA 0.02 M theo tỷ lệ thể tích bằng nhau để đạt thể tich tổng cộng là 10
ml trong một ống nghiệm và giữ ở nhiệt độ 90C trong 30 phút . Sau đó làm nguội
dưới vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng trước khi đi xác định độ hấp thu quang học ở bước sóng 532 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). Hàm lượng
Malonaldehyde (MAD) được tính toán từ đường cong chuẩn được xây dựng với
nồng độ MAD từ 0,01 đến 0,05 M. Kết quả được báo cáo là M MAD/g thịt cá.
Mỗi phân tích được thực hiện lặp lại hai lần. Kết quả báo cáo là giá trị trung bình
độ lệch chuẩn.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả thí nghiệm được xác định từ trung bình cộng của hai lần thí nghiệm độc lập. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel 2007. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên bản 16.0. Giá trị trung bình được phân tích ANOVA theo phép thử Ducan. Giá trị p < 0,05 chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết
Đồ thị hình 3.1; 3.2 và 3.3 mô tả ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết (ethanol) đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết rong mơ.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ethanol ở các nồng độ khác nhau
bao gồm 0, 30, 70 và 100%. Hình 3.1 trình bày kết quả ảnh hưởng của nồng độ của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số. Kết quả cho thấy nồng độ dung môi ethanol ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng polyphenol tổng số. Khi tăng nồng độ dung môi ethanol từ 0 đến 30%, hàm lượng polyphenol tổng số lên khoảng 2 lần
(p 0,05). Tuy nhiên, khi nồng độ ethanol tăng lên từ 30 đến 100% thì hàm lượng
polyphenol giảm dần (p 0,05). Cụ thể, khi sử dụng 30% ethanol để chiết, hàm
lượng polyphenol tổng số thu được là 13,13 mg GAE/g rong khô, trong khi sử dụng 70 và 100% ethanol để chiết thì hàm lượng giảm xuống tương ứng là 3,02 và 0,89 mg GAE/g rong khô. Như vậy, 30% ethanol cho hiệu quả thu hàm lượng polyphenol tổng số là cao nhất trong dải nồng độ dung môi nghiên cứu.
Dung môi chiết là một thông số quan trọng trong quá trình chiết các hợp chất từ nguyên liệu thực vật và động vật. Từ kết quả của nghiên cứu này chúng tôi thấy rằng nồng độ dung môi chiết (ethanol) có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết rong mơ. Kết quả này tương tự với nhiều nghiên cứu trước đây trên đối tượng rong biển và các loài thực vật trên cạn. Dent và cộng sự (2012) đã xác định khi sử dụng nồng độ dung môi ethanol 30% để chiết sẽ đem lại hiệu quả
nhất cho quá trình chiết các hợp chất polyphenol từ lá Salvia officinalis. Chew và
cộng sự (2011) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ethanol (0-100%) đến hàm lượng polyphenol tổng số của rau má. Kết quả cho thấy nồng độ ethanol có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng polyphenol của dịch chiết thu được. Nồng độ ethanol ở 40% được xác định là nồng độ cho hàm lượng polyphenol tổng số là cao nhất.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khả năng hòa tan polyphenol trong dung môi chiết phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi. Methanol là một trong những dung môi phù hợp nhất để tách polyphenol (De và cộng sự, 2005; Galvez và
cộng sự, 2005) 28, 36. Tuy nhiên, như đã đề cập ở trên methanol là một dung
môi độc tính, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của người sử dụng. Do vậy, ethanol là một dung môi được ưa thích sử dụng để tách các hợp chất polyphenol vì nó có tính
chất hóa học tương tự với methanol mà lại ít độc hại (Esther và cộng sự, 2003) 32.
Ethanol là dung môi phân cực mạnh nên dễ hòa tan các chất phân cực, ethanol có độ nhớt tương đối cao 1,20 cp sẽ làm cản trở dung môi thấm vào nguyên liệu nhưng lại có sức căng bề mặt khá nhỏ 20,03 dyn/cm nên hòa tan polyphenol dễ dàng. Mặc khác, độ nhớt và sức căng bề mặt của ethanol thấp hơn nước nên khi chiết trong dung môi ethanol thì dung môi này càng dễ thấm vào nguyên liệu,
không cản trở quá trình khuếch tán chất cần thiết hơn khi chiết trong nước 1.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng nồng độ ethanol 30% là thích hợp để chiết các hợp chất polyphenol từ rong mơ. Khi tăng nồng độ ethanol lên cao hơn 30% thì hiệu quả chiết giảm xuống rõ rệt. Kết quả này có thể được giải thích như sau: Khi tăng nồng độ ethanol thì độ nhớt của ethanol càng tăng cao nên sẽ làm cản trở dung môi thấm vào nguyên liệu, do đó khả năng hòa tan các hợp chất polyphenol thấp.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hàm lượng polyphenol tổng
Hình 3.2 trình bày kết ảnh hưởng của nồng độ của dung môi chiết đến tổng năng lực khử của rong mơ. Năng lực khử được đánh giá bằng độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm, độ hấp thụ càng lớn chứng tỏ năng lực khử càng cao. Kết quả cho thấy nồng độ dung môi ethanol ảnh hưởng rõ ràng đến tổng năng lực khử.
Khi nồng độ dung môi tăng từ 0 đến 30% thì năng lực khử tăng từ 0,74 đến 0,91. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ dung môi từ 30 đến 100% thì năng lực khử giảm và năng lực khử của dịch chiết thu được bằng dung môi 100% ethanol là
thấp nhất chỉ là 0,11 (p 0,05). Như vậy, kết quả này tương tự với sự ảnh hưởng
của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến tổng năng lực khử
(Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05)
Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH của rong mơ được trình bày ở hình 3.3. Kết quả cũng cho thấy nồng độ dung môi ethanol ảnh hưởng đáng kể đến khả năng khử gốc tự do DPPH. Cụ thể, dịch chiết thu được khi sử dụng 30% ethanol cho khả năng khử gốc tự do DPPH
(94,17%) là cao nhất (p 0,05), tiếp theo là 0% ethanol (58,68%), 70% ethanol
Như vậy, từ kết quả này có thể kết luận rằng, sự ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa là tương tự nhau. Do đó, các hợp chất polyphenol có thể là thành phần chính đóng góp vào khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến khả năng khử gốc tự do
DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05)
3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết
Đồ thị hình 3.4; 3.5 và 3.6 thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ.
Từ kết quả nghiên cứu ở đồ thị hình 3.4 cho thấy, nhiệt độ chiết có ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol. Kết quả này cũng phừ hợp với kết quả công bố
của Dent và cộng sự (2013) khi nghiên cứu trên đối tượng thực vật học (Salvia
officinalis), công bố này đã chỉ ra rằng hàm lượng polyphenol tổng số phụ thuộc
vào nhiệt độ chiết.
Khi tăng nhiệt độ chiết từ 30 đến 60C thì hàm lượng polyphenol tăng từ
3,33 đến 13,13 mg GAE/g rong khô. Khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên từ 60 đến 75C
có thể thấy tại nhiệt độ 60C sẽ cho hàm lượng polyphenol cao nhất 13,13 mg GAE/g rong khô. Kết quả nghiên cứu của Chew và cộng sự (2011) khi nghiên cứu
trên đối tượng rau má đã lựa chọn nhiệt độ tối ưu là 65C, nghiên cứu của
Benmeziane và cộng sự (2014) khi nghiên cứu trên đối tượng nho tươi đã báo cáo
nhiệt độ tối ưu để tách chiết polyphenol từ nho là 60C.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được rằng nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chiết các hợp chất polyphenol từ thực vật cũng như rong biển. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định được rằng hàm lượng polyphenol trích ly được
từ rong mơ tăng dần cùng với nhiệt độ chiết trong khoảng từ 30 đến 60C. Kết quả
này có thể được giải thích như sau: khi tăng nhiệt độ sẽ làm tăng cường khả năng hòa tan của chất tan và hệ số khuếch tán (Spigno và cộng sự, 2007). Khi nhiệt độ tăng cũng giúp cho quá trình bẽ gãy màng cellulose, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình giải phỏng phóng các hợp chất polyphenol. Ngoài ra, khi tăng nhiệt độ chiết có thể ức chế hoạt động của một số enzyme gây ra quá trình oxy hóa các hợp chất polyphenol, điều này cũng giúp hàm lượng polyphenol chiết được cao (Brijesh và cộng sự, 2012). Nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất, tốc độ phản ứng giữa các thành phần hóa học trong rong với cồn tăng làm tốc độ khếch tán các chất tan trong tế bào rong ra môi trường ngoài, vì vậy tốc độ hòa tan polyphenol sẽ tăng lên đẫn đến hàm lượng
polyphenol thu được cao 1. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ chiết cao thì có thể gây
phá hủy các hợp chất polyphenol đặc biệt là những chất không bền với nhiệt độ cao (Chew và cộng sự, 2011).
Do đó, khi nhiệt độ tăng cao đến 75C thì hàm lượng polyphenol có xu
hướng giảm. Điều đó có thể quan sát thấy rằng khi nhiệt độ cao đến điểm sôi của
ethanol là 78,5C thì làm mất dung môi ethanol. Khi đó, nồng độ các chất hữu cơ sẽ
tăng cao còn nồng độ dung môi giảm làm giảm phân cực, vì vậy gây bất lợi cho quá trình chiết polyphenol cũng như mang lại hiệu suất chiết các hợp chất polyphenol thấp (Liyana và cộng sự, 2005; Chan và cộng sự, 2009).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng 60C là nhiệt độ thích hợp để chiết các hợp chất polyphenol từ rong mơ. Kết quả này cũng tương tự với kết quả
công bố của Dent và cộng sự (2013) khi xác định 60C là nhiệt độ sẽ đem lại hiệu
quả nhất cho quá trình chiết các hợp chất polyphenol từ lá Salvia officinalis L.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng
số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05)
Từ đồ thị hình 3.5 cho thấy tổng năng lực khử của dịch chiết rong mơ tăng giảm theo nhiệt độ khác nhau. Năng lực khử được đánh giá bằng độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm, độ hấp thụ càng lớn chứng tỏ năng lực khử càng cao. Khi nhiệt độ
tăng từ 30 đến 60C thì tổng năng lực khử cũng tăng từ 0,71 đến 0,88 và khi nhiệt
độ tăng từ 60 đến 75C thì tổng năng lực khử lại giảm xuống từ 0,88 đến 0,76. Như
vậy, tương tự với kết quả của hàm lượng polyphenol tổng số, 60C là nhiệt độ chiết
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng năng lực khử
(Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05)
Hình 3.6 cho thấy nhiệt độ chiết cũng ảnh hưởng tới khả năng khử gốc tự do DPPH theo xu hướng tương tự như hàm lượng polyphenol tổng số và tổng năng lực
khử. Cụ thể, khi tăng nhiệt độ từ 30 đến 60C thì khả năng khử gốc tự do DPPH
tăng dần từ 57,13 đến 94,17% nhưng khi tiếp tục tăng nhiệt độ từ 60 đến 750C thì
khả năng khử gốc tự do DPPH cũng có xu hướng giảm từ 94,17 đến 80,13%.Như
vậy, dịch chiết thu được khi chiết ở nhiệt độ 60C có khả năng khử gốc tự do DPPH
(94,17%) cao nhất (p 0,05). Điều này có thể được giải thích như sau: Khi nhiệt độ
tăng quá cao thì hoạt tính chống oxy hóa giảm vì nhiệt độ tăng cao sẽ là tăng tốc độ phản ứng các thành phần trong rong và đẩy nhanh quá trình trao đổi chất. Do đó, những chất không bền với nhiệt sẽ bị phá hủy hoặc bị kích thích phản ứng làm thay đổi trạng thái ban đầu, vì vậy chúng sẽ cũng sẽ bị mất đi hoạt tính ban đầu.