Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Chiết Ethanol 0% Ethanol 100% Ethanol 70% Ethanol 30% Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa
Chọn nồng độ dung môi ethanol thích hợp
Sơ đồbố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ được mô tả ở hình 2.3. Cân chính xác 2 g nguyên liệu rong khô và cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Rong khô nguyên liệu được chiết bằng dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau bao gồm 0; 30; 70 và 100%. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung
môi/nguyên liệu (NL/DM) là 1/20 (w/v), nhiệt độ chiết là 60C và thời gian chiết là
30 phút, được giữ cố định. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH. 2.2.3.2. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Chiết 30C 45C 60C 75C Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được mô tả ở hình 2.4. Cân chính xác 2 g rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) là 1/20 (w/v), rong nguyên liệu được chiết bằng 30% ethanol ở các nhiệt độ khác nhau
bao gồm 30; 45; 60 và 75C, trong cùng khoảng thời gian là 30 phút. Quá trình
chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
2.2.3.3. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
Lọc
Dịch chiết
Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa
Chọn thời gian chiết thích hợp Rong mơ khô
(đã nghiền nhỏ)
Chiết
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ được mô tả ở hình 2.5. Cân chính xác khoảng 2 g rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) là 1/20 (w/v), rong nguyên liệu được chiết bằng 30% ethanol ở các thời
gian chiết khác nhau là 30; 60; 90 và 120 phút, tại cùng nhiệt độ là 60C. Quá trình
chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
2.2.3.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa
Chọn số lần chiết thích hợp Dịch chiết 1
Dịch chiết 2 Rong mơ khô (đã
nghiền nhỏ) Chiết lần 1 Bã rong Chiết lần 3 Dịch chiết 3 Chiết lần 2 Bã rong
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được mô tả ở hình 2.6. Cân chính xác khoảng 2 g rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) là
1/20 (w/v), rong nguyên liệu được chiết bằng 30% ethanol tại nhiệt độ là 60C trong
thời gian 30 phút. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 1). Phần bã thu được từ chiết lần 1 được tiếp tục chiết trong điều kiện như trên. Hỗn hợp chiết lần hai được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 2). Phần bã thu được từ lần chiết thứ hai tiếp tục thực hiện lần chiết thứ 3 với các điều kiện như trên. Hỗn hợp chiết lần ba được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 3). Dịch chiết thu được sau khi lọc từ ba lần chiết được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa.
2.2.3.5. Thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
Chiết Không sử dụng sóng siêu âm 0,3 ml dịch Có sử dụng sóng siêu âm Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphen ol tổng số Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH 0,5 ml dịch 0,1 ml dịch 0,2 ml dịch 1 ml dịch 0,7 ml dịch Xác định tổng năng lực khử Rong mơ khô
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được mô tả ở hình 2.7. Cân chính xác 2 g rong rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, rong nguyên liệu được chiết bằng 30%
ethanol, tại nhiệt độ là 60C trong thời gian 10 phút và bằng hai phương pháp chiết
khác nhau (chiết tĩnh và chiết có đánh sóng siêu âm). Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa. Từ đó so sánh được sự khác nhau giữa hai phương pháp chiết (chiết tĩnh và chiết có đánh sóng siêu âm).
Khi xác định tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH, ta dùng dịch chiết với các thể tích lần lượt khác nhau để so sánh ảnh hưởng của sóng siêu âm đến khả năng chống oxy hóa với các thể tích dịch chiết khác nhau. Cụ thể các thể tích dịch chiết được sử dụng như sau:
Xác định tổng năng lực khử: 0,1; 0,2 và 0,3 ml dịch chiết.
Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH: 0,5 ; 0,7 và 1 ml dịch chiết.
2.2.4. Thí nghiệm sử dụng dịch chiết rong mơ S. mcclurei để hạn chế sự oxy
hóa lipid trên thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh
Chuẩn bị dịch chiết cô đặc:
Cân chính xác 15 g nguyên liệu rong mơ khô cho vào bình nón thủy tinh có dung tích 500 ml. Tiếp theo, 300 ml dung dịch 30% ethanol được thêm vào và tiến hành chiết ở điều kiện chiết thích hợp đã được xác định ở các bước trên (nhiệt độ
chiết 60C, thời gian chiết 30 phút) trong bể ổn nhiệt (Elmasonic, Germany). Kết
thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman No. 11. Dịch chiết thu được cô đặc bằng máy cô quay chân không (Buchi-Thụy Sĩ) đến khối lượng không đổi. Sau đó, dịch chiết khô được hòa tan lại vào 40 ml nước cất và sử dụng để bảo quản thịt cá thu.
Xử lý nguyên liệu cá thu:
Cá thu nguyên liệu còn tươi được mua tại chợ Vĩnh Hải, thành phố Nha Trang, được bảo quản lạnh bằng nước đá trong thùng xốp và vận chuyển về phòng
thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang. Trước khi thí nghiệm, cá được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, rong rêu và một phần vi sinh vật bám trên bề mặt. Tiếp theo cá được fillet, loại bỏ da, rửa sạch để ráo và xay nhuyễn bằng máy nghiền trục vít. Thịt cá xay nhuyễn được sử dụng để nghiên cứu tác dụng hạn chế sự oxy hóa lipid của dịch chiết rong mơ.
Tiến hành thí nghiệm:
Cho chính xác 5 ml dịch chiết cô đặc vào 59 g thịt cá xay nhuyễn, trộn đều
và bảo quản trong khay nhựa ở 4C. Mẫu đối chứng cũng được chuẩn bị tương tự
như trên, ngoại trừ dịch chiết cô đặc được thay bằng nước cất. Sau 0, 1, 3, 5và 7 ngày bảo quản, tiến hành lấy mẫu và đánh giá sự oxy lipid bằng phươngpháp TBARS (hình 2.8).
Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm ứng dụng dịch chiết rong mơ để hạn chế sự oxy hóa
lipid thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh ở t=4C
Trộn thịt cá với dịch chiết cô đặc theo tỷ lệ 10/1 (w/v)
Bảo quản lạnh ở 4C trong môi trường
không khí lạnh
0 ngày
Đánh giá sự oxy hóa lipid theo phương pháp TBARS
7 ngày
1 ngày 3 ngày 5 ngày
Xử lý
Xay nhuyễn
2.3. Phương pháp phân tích 2.3.1. Xác định hàm ẩm 2.3.1. Xác định hàm ẩm
Hàm ẩm của rong mơ được xác định bằng phương pháp sấy khô đến khối
lượng không đổi 11. Phân tích được lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung
bình độ lệch chuẩn.
2.3.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singlton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Tóm tắt: Lấy 0,1 ml dịch chiết rong trộn với 0,9 ml nước cất trước khi thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và
2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được lắc đều rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
trước khi đo bước sóng ở 760 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi mg gallic acid tương đương (GAE)/g chất khô. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là
giá trị trung bình độ lệch chuẩn.
2.3.3. Xác định khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng khử gốc tự do của các mẫu khác nhau (Lee và cộng sự, 2003).
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định dựa theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Lấy 0,3 ml trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3 ml. Sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM (pha trong ethanol 99,5%), lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 517 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia).
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau:
DPPH (%) = 100 × (ACT – ASP)/ACT.
Trong đó:
ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết;
ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết.
Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là thể tích của dịch chiết khử được 50% gốc
tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do
DPPH càng cao. Vì vậy, hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh. Mỗi phân tích được
2.3.4. Xác định tổng năng lực khử
Năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Lấy 1 ml dịch chiết trộn với đệm phosphate pH=6,6 để đạt thể
tích cuối cùng 1,5 ml trước khi thêm 0,5 ml K3(Fe[CN] 6) 1%. Hỗn hợp được ủ ở
50C trong 20 phút, sau đó thêm 0,5 ml TCA 10 % và 2 ml nước cất, cuối cùng 0,4
ml AlCl3 0,1% được thêm vào rồi lắc đều. Độ hấp thu quang học được xác định ở
bước sóng 700 nm. Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh.
Kết quả được báo cáo bởi giá trị IC50, là lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học
lên 0,50. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị
trung bình độ lệch chuẩn.
2.3.5. Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S. mcclurei
trên thịt cá thu bảo quản lạnh
Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S. mcclurei được thử
nghiệm trên thịt cá thu bảo quản lạnh bằng cách xác định chỉ số TBARS (các chất phản ứng với acid Thiobarbituric). Phân tích TBARS đã được đề nghị cách đây hơn 40 năm và hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến để xác định sự oxy hóa lipid. Phương pháp đo Malonaldehyde (MDA) này được hình thành như sản phẩm tách ra của một endoperoxide của các acid béo không bão hòa từ sự oxy hóa lipid. Nó là tiền đề hình thành MDA từ các acid béo. MDA được phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) hình thành chất có màu hồng (TBARS) được đo quang phổ
hấp thụ ở bước sóng 532-535nm 49.
Các chất phản ứng với TBA được xác định theo phương pháp của Lemon (1957) với một sự hiệu chỉnh nhỏ. Tóm tắt: Khoảng 2 g thịt cá thu đã được xay nhuyễn trộn với 10 ml dung dịch chiết TCA 7,5% và tiến hành chiết trong thời gian 10 phút, sau đó lọc qua giấy lọc Whatman No.40. Phần dịch lọc thu được trộn với dung dịch TBA 0.02 M theo tỷ lệ thể tích bằng nhau để đạt thể tich tổng cộng là 10
ml trong một ống nghiệm và giữ ở nhiệt độ 90C trong 30 phút . Sau đó làm nguội
dưới vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng trước khi đi xác định độ hấp thu quang học ở bước sóng 532 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). Hàm lượng
Malonaldehyde (MAD) được tính toán từ đường cong chuẩn được xây dựng với
nồng độ MAD từ 0,01 đến 0,05 M. Kết quả được báo cáo là M MAD/g thịt cá.
Mỗi phân tích được thực hiện lặp lại hai lần. Kết quả báo cáo là giá trị trung bình
độ lệch chuẩn.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả thí nghiệm được xác định từ trung bình cộng của hai lần thí nghiệm độc lập. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel 2007. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên bản 16.0. Giá trị trung bình được phân tích ANOVA theo phép thử Ducan. Giá trị p < 0,05 chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết
Đồ thị hình 3.1; 3.2 và 3.3 mô tả ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết (ethanol) đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết rong mơ.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ethanol ở các nồng độ khác nhau
bao gồm 0, 30, 70 và 100%. Hình 3.1 trình bày kết quả ảnh hưởng của nồng độ của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số. Kết quả cho thấy nồng độ dung môi ethanol ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng polyphenol tổng số. Khi tăng nồng độ dung môi ethanol từ 0 đến 30%, hàm lượng polyphenol tổng số lên khoảng 2 lần