Quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Rong mơ S. mcclurei tươi Nghiền rong Lọc Dịch chiết Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống

oxy hóa (tổng năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH)

Bảo quản sản phẩm polyphenol từ dịch chiết

rong mơ S. mcclurei

Chiết

Bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết (nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, số lần chiết và sóng siêu âm) đến hàm lượng polyphenol tổng

số và khả năng chống oxy hóa

Bố trí thí nghiệm áp dụng dịch chiết

rong mơ S. mcclurei để hạn chế sự oxy

hóa lipid trên thịt cá thu bảo quản lạnh

Rửa

Giải thích quy trình:

Rong mơ tươi được thu mua tại Thành phố Nha Trang (Khánh Hòa). Nguyên liệu rong mơ dạng tươi (10 kg) được rửa sạch tạp chất và muối, sau đó phơi khô dưới ánh nắng mặt trời đến độ ẩm là 16,51%. Rong khô được nghiền nhỏ rồi đem bảo quản trong các túi PA trong điều kiện hút chân không, ở nhiệt độ phòng đến khi sử dụng. Sau đó rong được đem về phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nha Trang để tiến hành nghiên cứu. Chọn rong khô để nghiên cứu nhằm mục đích: rong khô có hàm ẩm nhỏ góp phần hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây hư hỏng rong, ức chế các quá trình tổng hợp và chuyển hóa trong rong. Bên cạnh đó, rong khô gọn, nhẹ nên được bảo quản dễ dàng, ít chiếm diện tích chứa đựng và thuận lợi trong việc vận chuyển trong quá trình tiến hành nghiên cứu. Đồng thời, khi hàm lượng ẩm trong nguyên liệu giảm, tốc độ trích ly tăng lên vì nước tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán.

Nghiền rong: Dùng máy nghiền để nghiền nhỏ rong vì rong nhỏ sẽ làm tăng diện tích tiếp xúc giữa rong với dung môi, góp phần phá vỡ cấu trúc tế bào rong, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi.

Rong sau khi được nghiền nhỏ, một phần nhỏ được đem đi xác định độ ẩm. Chiết: Hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa (năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH) đều bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong quá trình chiết như nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, số lần chiết và sóng siêu âm. Do đó, tại công đoạn chiết này sẽ tiến hành bố trí các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trên để tìm môi trường chiết cho hoạt tính mong muốn cao.

Lọc: Mẫu sau khi chiết sẽ được lọc qua giấy lọc để thu dịch có chứa hợp chất cần thiết, loại bỏ những tạp chất không tan như cặn và bã rong.

Dịch chiết thu được sẽ được đem đi bố trí các thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa (tổng năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH).

Sau khi xác định được môi trường chiết thích hợp cho hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa cao thì tiến hành bố trí thí nghiệm áp dụng dịch chiết rong để hạn chế oxy hóa lipid trên thịt cá thu bảo quản lạnh.

Phần dịch chiết chưa sử dụng sẽ được bảo quản lạnh. 2.2.2. Thí nghiệm xác định độ ẩm của rong mơ khô

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm của rong mơ khô Sơ đồ bố thí nghiệm xác định độ ẩm được mô tả ở hình 2.2.

Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc được rửa sạch, úp khô, sấy ở nhiệt

độ 105C trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân, sau đó sấy

tiếp ở nhiệt độ trên, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân và sấy đến khi

nào khối lượng giữa hai lần liên tiếp sai khác không quá 5.10-4 g là được (khối

lượng không đổi).

Cân chính xác khoảng 5 g rong cho vào cốc đã sấy đến khối lượng không đổi. Đánh tơi mẫu bằng đũa thủy tinh, dàn đều mẫu trên đáy cốc. Chuyển cốc vào tủ

sấy, sấy ở nhiệt độ 60C trong 2 giờ. Sau đó, nâng nhiệt độ lên 105C, sấy liên tục

trong 3 giờ. Chú ý trong quá trình sấy cứ sau 1 giờ đảo mẫu một lần. Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm rồi cân trên cân phân tích, sau đó sấy tiếp đến khối lượng không đổi như trên.

Sấy đến khối lượng không đổi

Làm nguội

Cân

Tính kết quả Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ)

Tính kết quả: Công thức xác định hàm ẩm: W=(G1-G2)/(G1-G)*100(%) Trong đó: W: Độ ẩm của nguyên liệu (%)

G: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng đổi (g)

G1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g)

G2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)

2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm cần chú ý: Rong tránh tiếp xúc với ánh sáng mặt trời do polyphenol dễ bị phân hủy, thường xuyên kiểm tra nhiệt độ trong quá trình chiết và khi thời gian thực hiện quá dài thì cần thường xuyên kiểm tra các điều kiện còn lại để đảm bảo độ chính xác.

2.2.3.1. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết

Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ

Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Chiết Ethanol 0% Ethanol 100% Ethanol 70% Ethanol 30% Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa

Chọn nồng độ dung môi ethanol thích hợp

Sơ đồbố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ được mô tả ở hình 2.3. Cân chính xác 2 g nguyên liệu rong khô và cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Rong khô nguyên liệu được chiết bằng dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau bao gồm 0; 30; 70 và 100%. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung

môi/nguyên liệu (NL/DM) là 1/20 (w/v), nhiệt độ chiết là 60C và thời gian chiết là

30 phút, được giữ cố định. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH. 2.2.3.2. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết

Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ

Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Chiết 30C 45C 60C 75C Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa

Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được mô tả ở hình 2.4. Cân chính xác 2 g rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) là 1/20 (w/v), rong nguyên liệu được chiết bằng 30% ethanol ở các nhiệt độ khác nhau

bao gồm 30; 45; 60 và 75C, trong cùng khoảng thời gian là 30 phút. Quá trình

chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.

2.2.3.3. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết

Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ

Lọc

Dịch chiết

Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa

Chọn thời gian chiết thích hợp Rong mơ khô

(đã nghiền nhỏ)

Chiết

Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ được mô tả ở hình 2.5. Cân chính xác khoảng 2 g rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) là 1/20 (w/v), rong nguyên liệu được chiết bằng 30% ethanol ở các thời

gian chiết khác nhau là 30; 60; 90 và 120 phút, tại cùng nhiệt độ là 60C. Quá trình

chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.

2.2.3.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết

Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ

Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa

Chọn số lần chiết thích hợp Dịch chiết 1

Dịch chiết 2 Rong mơ khô (đã

nghiền nhỏ) Chiết lần 1 Bã rong Chiết lần 3 Dịch chiết 3 Chiết lần 2 Bã rong

Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được mô tả ở hình 2.6. Cân chính xác khoảng 2 g rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) là

1/20 (w/v), rong nguyên liệu được chiết bằng 30% ethanol tại nhiệt độ là 60C trong

thời gian 30 phút. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 1). Phần bã thu được từ chiết lần 1 được tiếp tục chiết trong điều kiện như trên. Hỗn hợp chiết lần hai được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 2). Phần bã thu được từ lần chiết thứ hai tiếp tục thực hiện lần chiết thứ 3 với các điều kiện như trên. Hỗn hợp chiết lần ba được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 3). Dịch chiết thu được sau khi lọc từ ba lần chiết được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa.

2.2.3.5. Thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm

Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ

Chiết Không sử dụng sóng siêu âm 0,3 ml dịch Có sử dụng sóng siêu âm Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphen ol tổng số Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH 0,5 ml dịch 0,1 ml dịch 0,2 ml dịch 1 ml dịch 0,7 ml dịch Xác định tổng năng lực khử Rong mơ khô

Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được mô tả ở hình 2.7. Cân chính xác 2 g rong rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, rong nguyên liệu được chiết bằng 30%

ethanol, tại nhiệt độ là 60C trong thời gian 10 phút và bằng hai phương pháp chiết

khác nhau (chiết tĩnh và chiết có đánh sóng siêu âm). Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa. Từ đó so sánh được sự khác nhau giữa hai phương pháp chiết (chiết tĩnh và chiết có đánh sóng siêu âm).

Khi xác định tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH, ta dùng dịch chiết với các thể tích lần lượt khác nhau để so sánh ảnh hưởng của sóng siêu âm đến khả năng chống oxy hóa với các thể tích dịch chiết khác nhau. Cụ thể các thể tích dịch chiết được sử dụng như sau:

Xác định tổng năng lực khử: 0,1; 0,2 và 0,3 ml dịch chiết.

Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH: 0,5 ; 0,7 và 1 ml dịch chiết.

2.2.4. Thí nghiệm sử dụng dịch chiết rong mơ S. mcclurei để hạn chế sự oxy

hóa lipid trên thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh

Chuẩn bị dịch chiết cô đặc:

Cân chính xác 15 g nguyên liệu rong mơ khô cho vào bình nón thủy tinh có dung tích 500 ml. Tiếp theo, 300 ml dung dịch 30% ethanol được thêm vào và tiến hành chiết ở điều kiện chiết thích hợp đã được xác định ở các bước trên (nhiệt độ

chiết 60C, thời gian chiết 30 phút) trong bể ổn nhiệt (Elmasonic, Germany). Kết

thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman No. 11. Dịch chiết thu được cô đặc bằng máy cô quay chân không (Buchi-Thụy Sĩ) đến khối lượng không đổi. Sau đó, dịch chiết khô được hòa tan lại vào 40 ml nước cất và sử dụng để bảo quản thịt cá thu.

Xử lý nguyên liệu cá thu:

Cá thu nguyên liệu còn tươi được mua tại chợ Vĩnh Hải, thành phố Nha Trang, được bảo quản lạnh bằng nước đá trong thùng xốp và vận chuyển về phòng

thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang. Trước khi thí nghiệm, cá được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, rong rêu và một phần vi sinh vật bám trên bề mặt. Tiếp theo cá được fillet, loại bỏ da, rửa sạch để ráo và xay nhuyễn bằng máy nghiền trục vít. Thịt cá xay nhuyễn được sử dụng để nghiên cứu tác dụng hạn chế sự oxy hóa lipid của dịch chiết rong mơ.

Tiến hành thí nghiệm:

Cho chính xác 5 ml dịch chiết cô đặc vào 59 g thịt cá xay nhuyễn, trộn đều

và bảo quản trong khay nhựa ở 4C. Mẫu đối chứng cũng được chuẩn bị tương tự

như trên, ngoại trừ dịch chiết cô đặc được thay bằng nước cất. Sau 0, 1, 3, 5và 7 ngày bảo quản, tiến hành lấy mẫu và đánh giá sự oxy lipid bằng phươngpháp TBARS (hình 2.8).

Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm ứng dụng dịch chiết rong mơ để hạn chế sự oxy hóa

lipid thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh ở t=4C

Trộn thịt cá với dịch chiết cô đặc theo tỷ lệ 10/1 (w/v)

Bảo quản lạnh ở 4C trong môi trường

không khí lạnh

0 ngày

Đánh giá sự oxy hóa lipid theo phương pháp TBARS

7 ngày

1 ngày 3 ngày 5 ngày

Xử lý

Xay nhuyễn

2.3. Phương pháp phân tích 2.3.1. Xác định hàm ẩm 2.3.1. Xác định hàm ẩm

Hàm ẩm của rong mơ được xác định bằng phương pháp sấy khô đến khối

lượng không đổi 11. Phân tích được lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung

bình  độ lệch chuẩn.

2.3.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singlton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Tóm tắt: Lấy 0,1 ml dịch chiết rong trộn với 0,9 ml nước cất trước khi thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và

2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được lắc đều rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút