Các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai chiều đƣợc cắt ra khỏi bản gel. Lúc này các phân tử protein nằm trong gel polyacrylamide liên kết với phân tử thuốc nhuộm Coomassie. Do đó, trƣớc tiên cần phải loại bỏ chất màu Coomassie. Protein trong các spot đƣợc thủy phân thành các peptide để chuẩn bị cho phân tích khối phổ. Loại enzyme đƣợc sử dụng để thủy phân protein là trypsin. Enzyme này có tác dụng cắt phân tử protein tại các gốc Lysine (K) và Arginine (R) ở đầu C và không cắt khi các gốc này liên kết với Prolin (P). Khi đó, phân tử protein đƣợc cắt thành các mảnh peptide có kích thƣớc từ 6 – 20 acid amin, thích hợp cho phân tích khối phổ về sau [1]. Quá trình tẩy màu các spot, thủy phân protein thành các mảnh peptide sẵn sàng cho phân tích khối phổ bao gồm các bƣớc cụ thể nhƣ sau:
- Cắt spot ra khỏi bản gel. - Rửa spot bằng nƣớc Mini Q.
- Tẩy màu spot bằng dung dịch chứa ammonium bicarbonate (ABC) 50mM, acetonitrile (AcCN) 50%.
- Làm khô spot bằng AcCN 100%.
- Ủ spot protein với dung dịch enzyme trypsin hoạt động qua đêm ở 37o
C để enzyme cắt hoàn toàn phân tử protein thành các mảnh peptide, chui ra khỏi gel polyacrylamide và đi vào dịch thủy phân.
Các peptide trong dịch thủy phân sẽ đƣợc hấp phụ bằng Ziptip C18 theo quy trình sau:
- Làm ƣớt Ziptip bằng dung dịch có trifluoroacetic acid (TFA) 0,1% trong AcCN 70%.
- Cân bằng Ziptip bằng dung dịch chứa TFA 0,1 %. - Hấp phụ peptide trong dịch thủy phân vào Ziptip.
35 - Loại muối bằng TFA 0,1%.
- Thôi peptide ra khỏi Ziptip lên đĩa MS bằng dung dịch TFA 0,1% trong AcCN 70%.
- Cuối cùng, bổ sung lên đĩa MS dung dịch chất nền (CHCA 10mg/ml trong TFA 0,05%, AcCN 50%).