Kỹ thuật điện di hai chiều đƣợc sử dụng để phân tách các protein trong mẫu thành các điểm riêng rẽ, trong đó chiều điện di thứ nhất là điện di phân vùng đẳng điện (IEF) để phân tách các protein theo điểm đẳng điện (pI) và chiều điện di thứ
32
hai là điện di SDS-PAGE để phân tách protein theo khối lƣợng và hình dạng. Quá trình này đƣợc bắt đầu bằng việc làm trƣơng thanh strip có gradient pH cố định bằng đệm trƣơng gel có chứa protein. Sau 1,5 giờ dung dịch sẽ ngấm vào thanh strip. Lƣợng protein tối đa mà sợi gel IPG strip pH 3 - 10 dài 17cm có thể thấm đƣợc là 400µg.
Điện di đẳng điện đƣợc thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell hoặc Ettan IPGphor3 để tập trung các phân tử protein vào vị trí tƣơng ứng với pI của phân tử đó trên thanh IPG strip. Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 5 bƣớc đƣợc trình bày trong bảng 3.
Bảng 3. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm
Bƣớc Hiệu điện thế V Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng U
Bƣớc 1 50 12 giờ … Trƣơng gel
Bƣớc 2 125 2 giờ … Tuyến tính
Bƣớc 3 250 15 phút … Nhanh
Bƣớc 4 10.000 2 giờ … Chậm
Bƣớc 5 10.000 … 40.000 Vh Nhanh
Tổng ≈ 20 giờ ≈ 60.000
Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh strip đƣợc ngâm trong đệm cân bằng I (Tris HCl 50mM, pH 8,8; Urea 6M; glycerol 30%; SDS 2%; DTT 0,1%) ở nhiệt độ phòng và đệm cân bằng II (Tris HCl 50mM, pH 8,8; Urea 6M; glycerol 30%; SDS 2%; IAA 0,25%) thực hiện trong bóng tối cũng ở nhiệt độ phòng. Mỗi bƣớc cân bằng đƣợc thực hiện 3 lần, thời gian mỗi lần theo thứ tự là: 5 phút, 10 phút, 10 phút. Điện di chiều hai đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Kết thúc điện di chiều hai, các protein đƣợc cố định 45 phút trong dung dịch chứa axít phosphoric 1,3%, methanol 20%, sau đó nhuộm bằng dung dịch Coomassie G250 qua đêm theo phƣơng pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff
33
(1988). Phƣơng pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein [43].