Để phân tích cả hệ gồm nhiều protein, kỹ thuật proteomics cần có sự hỗ trợ của 4 công cụ phân tích sau:
Công cụ đầu tiên là cơ sở dữ liệu. Các dữ liệu về protein, các trình tự biểu hiện đƣợc đánh dấu và trình tự genome hoàn chỉnh là một dữ liệu đầy đủ và chọn lọc cho tất cả các protein biểu hiện trong các cơ thể. Ví dụ, khi phân tích các trình tự mã hóa của ruồi giấm Drosophila, chúng ta đã biết rằng có 110 gen mã hóa cho protein có domain EGF và 87 gen mã hóa cho protein có domain có hoạt tính tyrosin kinase. Vì vậy, khi phân tích proteomics đối với Drosophila, mặc dù phải dựa trên một cơ sở dữ liệu lớn nhƣng chúng ta vẫn dự đoán đƣợc các protein có thể xuất hiện [24Error! Reference source not found.].
Công cụ thứ hai là khối phổ, đây là bộ phận trung tâm và cơ bản của phân tích proteomics. Phƣơng pháp khối phổ xuất hiện từ những năm đầu của thế kỷ XX do Thomson và các nhà khoa học khác tìm ra từ năm 1912. Nó đóng vai trò quan
18
trọng trong việc xác định cấu trúc của những phân tử nhỏ. Sau đó, phƣơng pháp này cũng đƣợc cải tiến để ứng dụng trong nghiên cứu sinh học, đặc biệt là xác định cấu trúc của các đại phân tử nhƣ protein. Proteomics dựa trên nguyên lý khối phổ đã trở thành một môn khoa học thật sự nhờ các dữ liệu về trình tự gen, trình tự protein cùng với nhiều thành tựu kỹ thuật vƣợt bậc trong nghiên cứu nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt phải kể đến sự phát triển của phƣơng pháp ion hóa protein. Các kỹ thuật này là những kỹ thuật không thể thiếu trong việc phân tích, nhận dạng những thông tin đƣợc mã hóa trong hệ gen.
Trong những năm gần đây, khối phổ (MS) đã trở thành công cụ đƣợc lựa chọn để phân tích hệ protein. Kỹ thuật này phân tích các protein hay các mảnh peptide theo tỷ số m/z (khối lƣợng/độ tích điện). Một cách đơn giản, các protein cần phân tích bị phân cắt thành các mảnh peptide có kích thƣớc thích hợp. Các mảnh peptide này bị ion hóa, nhờ đó tích điện và di chuyển tự do. Để xác định khối lƣợng của các ion này, ngƣời ta gia tốc chúng trong một buồng chân không, để đo thời gian bay (Time of Flight – TOF) của chúng. Nhƣ vậy, các ion sẽ đƣợc xác định theo khối lƣợng dựa vào thời gian bay trong buồng chân không và theo điện tích chúng mang. Sản phẩm cuối cùng là một phổ khối lƣợng gồm nhiều đỉnh. Phổ này sẽ là tín hiệu đặc trƣng để nhận dạng các protein.
Công cụ thiết yếu thứ ba là hệ thống phần mềm có thể so sánh, đối chiếu dữ liệu khối phổ với các trình tự protein đặc trƣng trong cơ sở dữ liệu. Việc xác định trình tự của một peptide từ các số liệu khối phổ là hoàn toàn có thể thực hiện đƣợc. Tuy nhiên, việc xác định trình tự de novo này là nhiệm vụ khá nặng nề và tốn thời gian, không thể áp dụng để phân tích hàng trăm, hàng nghìn phổ. Các phần mềm này cho phép điều tra tự động một lƣợng lớn dữ liệu khối phổ, đối chiếu với trình tự protein. Ngƣời nghiên cứu có thể kiểm tra các kết quả và đánh giá chất lƣợng của dữ liệu trong thời gian ngắn hơn và trên quy mô rộng hơn.
Công cụ thiết yếu thứ tƣ trong nghiên cứu proteomic là các kỹ thuật phân tách protein. Công việc phân tách protein nhằm hai mục đích chính. Thứ nhất, nó
19
làm đơn giản các phức hệ protein phức tạp bằng cách phân tách chúng thành các phân tử hay nhóm nhỏ protein độc lập. Thứ hai, việc phân tách này cho cái nhìn tổng quan về sự khác biệt của hệ protein giữa hai mẫu khác nhau, nhờ đó xác định đƣợc các protein đặc trƣng để phân tích. Ngày nay, hai dạng phân tích proteomics chủ đạo đƣợc sử dụng là: điện di hai chiều kết hợp với khối phổ và sắc ký hai chiều kết hợp với khối phổ.
Điện di hai chiều là kỹ thuật tốt nhất cho việc phân tách các protein trong một mẫu phức tạp. Kỹ thuật này phân tách các protein dựa vào hai thông số: điểm đẳng điện và khối lƣợng phân tử của protein, do đó có độ phân giải cao. Bản điện di hai chiều trên gel polyacrylamide sẽ là bức tranh đầy đủ nhất của một mẫu protein phức tạp. Hơn nữa, kỹ thuật điện di hai chiều cũng cho phép nghiên cứu biểu hiện protein của các dạng bệnh lý hay các giai đoạn khác nhau của quá trình phát triển.
Ngoài ra, các kỹ thuật phân tách khác nhƣ điện di một chiều trên gel polyacrylamide có SDS, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE), điện di phân vùng đẳng điện (IEF) và sắc ký ái lực đều có thể trở thành công cụ hữu hiệu trong phân tích proteomics. Tuy nhiên, có lẽ hiệu quả nhất vẫn là kỹ thuật sắc ký lỏng đa chiều (Multidimentional Liquid Chromatography-MDLC). Sắc ký trao đổi ion kết hợp vơi sắc ký pha đảo trong HPLC là một công cụ mạnh trong việc phân tách hỗn hợp peptide [24Error! Reference source not found.].