Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tách chiết protein từ mô ung thƣ đại trực tràng (mẫu bệnh) và mô đại trực tràng bình thƣờng (mẫu đối chứng) của cùng một bệnh nhân. Mẫu mô đƣợc cắt nhỏ, ngâm trong đệm PBS 0,05M, pH 7,4 và đệm phá tế bào lysis rồi thực hiện các bƣớc ly tâm để thu lấy các phân đoạn dịch chiết protein. Kết quả tách chiết đƣợc kiểm tra bằng điện di SDS - PAGE (hình 4).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 4. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng trên cùng bản gel polyacrylamide 10% có SDS
Giếng 1, 2, 3, 4, 5: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2, lysis 3 thu được từ mô đại trực tràngbình thường.
Giếng 6, 7, 8, 9, 10: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2, lysis 3 thu được từ mô ung thư đại trực tràng.
Trong điê ̣n di SDS - PAGE, các protein đƣợc phân tách theo khối lƣợng phân tử, các protein có khối lƣợng phân tử khác nhau thì đƣợc hiện lên dƣới dạng từng vạch băng khác nhau. Hiệu quả tách chiết protein đƣợc đánh giá thông qua số lƣợng các băng và độ đậm nhạt của các băng. Khi nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm có chứa Coomassie, băng protein bắt màu thuốc nhuô ̣m càng đâ ̣m chƣ́ng tỏ hàm lƣợng protein loa ̣i đó càng lớn . Số lƣợng băng trong mô ̣t giếng điê ̣n di càng nhiều , thành phần protein của mẫu càng đa dạng phong phú . Ngoài ra, kết quả điện di SDS –
38
PAGE còn bị ảnh hƣởng bởi các thành phần không phải là protein nhƣ mỡ, cặn tế bào, ADN, ARN… Khi có mặt của những thành phần này trong dịch chiết, kết quả điện di sẽ xuất hiện những vệt dọc, kéo dài và bắt màu đậm với thuốc thuộm.
Hình 4 cho thấy kết quả điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết thô protein từ mẫu mô đại trực tràng. Nhìn vào kết quả điện di chúng tôi thấy trong các giếng đã xuất hiện nhiều băng protein trải đều từ trên xuống dƣới chứng tỏ đã tách chiết thành công protein từ mô đại trực tràng và thành phần protein thu đƣợc trong mẫu là đa dạng và phong phú. Trong các mẫu, phân đoạn PBS 2, lysis 2 và lysis 3 (giếng số 2, 4, 5 và 7, 9, 10) có các băng vạch rõ nét và không có hoặc ít có vệt kéo dài từ trên xuống dƣới. Điều này chứng tỏ các phân đoạn này là tƣơng đối sạch, ít bị lẫn các thành phần phi protein. Bên cạnh đó, các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 (giếng số 1, 3 và 6, 8) của các mẫu có các băng protein hiện lên chƣa rõ ràng và xuất hiện hiện tƣợng kéo vệt dọc theo chiều dài giếng. Điều này chứng tỏ các phân đoạn này có thể lẫn các thành phần phi protein trong mẫu. Do đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu của các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100% ở -20oC. Protein sau khi tủa đƣợc hòa tan lại bằng chính đệm lysis và đƣợc điện đi kiểm tra trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Kết quả điện di kiểm tra mẫu tủa đƣợc cho trong hình 5.
39
Hình 5. Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1 từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng trên bản gel
polyacrylamide 10% có SDS
Giếng 1, 2,: Lần lượt là mẫu tủa của các phân đoạn dịch chiết PBS 1, lysis 1 thu được từ mô đại trực tràngbình thường.
Giếng 3, 4: Lần lượt là mẫu tủa của các phân đoạn dịch chiết PBS 1, lysis 1 thu được từ mô ung thư đại trực tràng.
Kết quả điện di kiểm tra cho thấy các mẫu dịch chiết phân đoạn PBS 1 và lysis 1 sau khi tủa bằng acetone đã xuất hiện những băng vạch rõ nét, không còn các vệt dọc kéo dài trên bản gel. Điều này chứng tỏ mẫu sau khi tủa đã loại đƣợc đáng kể các thành phần phi protein trong mẫu dịch chiết thô ban đầu. Mẫu sau khi tủa có thể sử dụng cho các phân tích tiếp theo.
Các phân đoạn khác nhau của mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đƣợc trộn lại với nhau tạo thành dịch chiết protein đầy đủ của mô đại trực tràng dùng để tiến hành bƣớc thí nghiệm tiếp theo.