Trên thế giới, sự phát triển của nghiên cứu proteomics đƣợc đánh dấu bằng sự ra đời của tổ chức nghiên cứu hệ protein ngƣời (Human Proteome Organisation– HUPO) tại Pháp năm 2002. Đây là tổ chức lớn nhất trên thế giới về nghiên cứu proteomics. Bên cạnh đó còn có các tổ chức khu vực, trong đó có tổ chức AOHUPO (Asia Oceania Human Proteome Organisation) thuộc châu Á-châu Đại Dƣơng.
Một trong những ứng dụng quan trọng đầu tiên của proteomics là trong lĩnh vực nghiên cứu ung thƣ. Việc tìm ra những biến đổi trong hệ protein của bệnh nhân ung thƣ có thể giúp các nhà khoa học tìm hiểu rõ hơn về cơ chế phát sinh bệnh ở
20
mức độ phân tử. Các protein biến đổi cũng có thể trở thành các chỉ thị sinh học mới góp phần sàng lọc, chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển của bệnh. Ngoài ra, kỹ thuật proteomics còn đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu đích tác dụng của thuốc điều trị, qua đó tìm ra các thuốc có hiệu quả điều trị tối ƣu.
Với những tính năng ƣu việt, proteomics là công cụ đƣợc các nhà khoa học lựa chọn trong nghiên cứu ung thƣ nói chung và ung thƣ đại trực tràng nói riêng. Đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng công cụ proteomics đƣợc thực hiện trên thế giới nhằm tìm ra các chỉ thị sinh học đặc trƣng cho ung thƣ đại trực tràng. Hệ protein đƣợc phân tích trong các nghiên cứu này có thể là hệ protein mô ung thƣ đại trực tràng, hệ protein trong huyết tƣơng, hệ protein từ dịch cơ thể nhƣ nƣớc tiểu.
Phân tích proteomics huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng
Huyết tƣơng tách từ máu ngƣời là một hệ protein tuyệt vời cho phân tích proteomics. Nó tập hợp các protein từ các mô khác nhau trong cơ thể. Những hiểu biết về hệ protein huyết tƣơng mang lại những thông tin quan trọng về nhiều quá trình sinh học diễn ra trong cơ thể. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng protein huyết tƣơng có thể là các chỉ thị sinh học đáng tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh nhƣ: ung thƣ buồng trứng (CA 13-5), ung thƣ tuyến tiền liệt (PAP), ung thƣ gan (- fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-ractive protein) [14]. Tuy nhiên, do trong huyết tƣơng chứa hàm lƣợng lớn (55%) là albumin, nên trƣớc khi tiến hành các kỹ thuật proteomics, chúng ta phải loại bỏ tối đa lƣợng albumin có trong mẫu huyết tƣơng.
Chỉ thị sinh học đƣợc tìm thấy trong huyết tƣơng là chỉ thị lý tƣởng cho chẩn đoán ung thƣ do rất dễ dàng thu thập mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân và việc chẩn đoán sẽ dễ dàng hơn. Hiện nay, chỉ thị CEA có mặt trong máu đang đƣợc ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng. Tuy nhiên, nhƣ đã đề cập ở trên, sử dụng chỉ thị CEA chỉ có khả năng phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn III, IV). Hơn nữa, chi phí cho xét nghiệm CEA tƣơng đối cao. Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm thêm các chỉ thị sinh học trong máu để ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị
21
ung thƣ đại trực tràng là hết sức cần thiết. Nhiều nghiên cứu proteomics trong huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đã đƣợc tiến hành nhằm tìm ra các chỉ thị sinh học mới cho loại ung thƣ này.
Năm 2004, Yu và cs đã tiến hành phân tích proteomics huyết tƣơng của 182 mẫu khác nhau gồm 55 mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, 35 mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân u tuyến đại trực tràng và 92 mẫu huyết tƣơng của ngƣời bình thƣờng. Bằng kỹ thuật SELDI-TOF MS kết hợp với công cụ tin sinh học, các nhà khoa học đã tìm ra 7 protein biểu hiện khác biệt giữa ung thƣ đại trực tràng và u tuyến đại trực tràng. Các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học với độ đặc hiệu 83% và độ nhạy là 89%. Nghiên cứu cũng chỉ ra 4 protein khác biệt giữa bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và ngƣời bình thƣờng. Các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học với độ đặc hiệu 92% và độ nhạy là 89% [39].
Năm 2005, với kỹ thuật SELDI-TOF/MS, Albrethsen và cs đã so sánh các protein có trong mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại tràng với huyết tƣơng của ngƣời khỏe mạnh và protein có trong mô ung thƣ đại tràng với mô đại tràng bình thƣờng. Nghiên cứu này cho thấy hàm lƣợng các protein HNP- 1, HNP- 2 và HNP- 3, còn đƣợc gọi là α-defensin-1, α-defensin-2, α-defensin-3 tăng lên trong huyết tƣơng của ngƣời bệnh và trong mô tại vị trí khối u. Một phần của protein HNP 1-3 sẽ kết hợp với loại protein khối lƣợng lớn chƣa xác định trong huyết tƣơng. Nhóm nghiên cứu đề xuất rằng HNP 1-3 có thể đƣợc coi nhƣ chỉ thị sinh học trong máu của bệnh nhân ung thƣ đại tràng. Các protein HNP 1-3 có thể có tác động lên quá trình phát triển khối u [4Error! Reference source not found.].
Việc tìm ra protein HNP 1-3 có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học trong máu có ý nghĩa quan trọng, có thể ứng dụng trong việc chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, việc nghiên cứu biểu hiện khác biệt của loại protein này trong các giai đoạn phát triển bệnh khác nhau sẽ giúp dự đoán hiệu quả ứng dụng của protein này trong chẩn đoán (có thể chẩn đoán ở giai đoạn sớm hay giai đoạn muộn của bệnh), cũng nhƣ có thể giúp phát hiện chính xác giai đoạn ung thƣ. Phát triển kết quả của các nghiên
22
cứu trƣớc đó, năm 2006, Albrethsen và cs tiếp tục nghiên cứu mức độ biểu hiện của các protein HNP 1-3 trong huyết thanh và trong mô ung thƣ đối với các giai đoạn bệnh khác nhau (theo Duke). Hàm lƣợng HNP 1-3 trong huyết tƣơng, trong mô ung thƣ và trong mô bình thƣờng đƣợc định lƣợng bằng khối phổ. Mức độ biểu hiện của HNP 1-3 trong huyết tƣơng đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng HNP 1-3 tăng lên ở mô ung thƣ của bệnh nhân ở giai đoạn từ Duke A đến Duke D so với mô thƣờng. Tuy nhiên, hàm lƣợng HNP 1-3 trong huyết tƣơng của bệnh nhân chỉ cao hơn huyết tƣơng của ngƣời khỏe mạnh khi bệnh nhân ở giai đoạn Duke D. Nồng độ protein HNP 1-3 đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA tăng lên ở giai đoạn Duke C và D, nhƣng không có sự khác biệt ở giai đoạn Duke A, B so với nồng độ HNP huyết tƣơng của ngƣời khỏe mạnh [5Error! Reference source not found.]. Nhƣ vậy, việc ứng dụng protein HNP 1-3 trong chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng cũng còn hạn chế, do chỉ phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn của bệnh.
Ngoài các nghiên cứu nhằm tìm kiếm chỉ thị sinh học để chẩn đoán bệnh trong giai đoạn sớm, các nhà khoa học còn tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc trƣng cho tình trạng di căn của ung thƣ đại trực tràng. Năm 2010, Xue và cs đã tiến hành nghiên cứu với mục đích nhƣ vậy. Bằng kỹ thuật LC-MS/MS, các nhà khoa học đã so sánh mức độ thay đổi lƣợng các chất tiết vào trong máu từ các dòng tế bào ung thƣ ban đầu và dòng tế bào đã di căn đƣợc lấy trên cùng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. 6 protein khác biệt đặc trƣng đã đƣợc xác nhận bằng kỹ thuật Western blot. Trong đó, yếu tố trefoil 3 và yếu tố biệt hóa/sinh trƣởng 15 là 2 protein có biểu hiện tăng ở các dòng tế bào đã di căn. Sử dụng kỹ thuật ELISA bánh kẹp cũng chỉ ra rằng 2 protein này có mức độ biểu hiện tăng lên đáng kể trong huyết tƣơng ở ung thƣ đại trực tràng đã di căn tới hạch bạch huyết. Kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu này có thể cho thấy trefoil 3 và yếu tố biệt hóa/sinh trƣởng 15 có trong huyết tƣơng có thể ứng dụng đƣợc để chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng đã di căn [37].
Cũng trong năm 2010, Trịnh Hồng Thái và cs đã sử dụng kỹ thuật điện di hai chiều kết hợp với phân tích khối phổ MALDI-TOF MS để phân tích biểu hiện
23
protein khác biệt trong mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và ngƣời bình thƣờng. Phân tích 40 spot protein biểu hiện khác biệt, các nhà khoa học đã nhận dạng đƣợc 35 protein, trong đó 31 protein đã đƣợc định danh và 4 protein giả thuyết. Các protein đƣợc chia thành 4 nhóm chức năng: các protein tham gia quá trình miễn dịch (19,35%), protein liên quan đến chu trình tế bào (9,68%), các protein tham gia vào quá trình apoptosis (12,9%) và nhóm protein khác (58,7%). Trong các protein nhận dạng đƣợc, một số protein biểu hiện khác biệt đáng chú ý nhƣ Interleukin 6, Cyclin D1, Hsp 70 biểu hiện tăng ở huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng so với ngƣời khỏe mạnh. Đặc biệt, protein Hsp 70 và Interleukin 6 là hai protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học cho ung thƣ đại trực tràng (số liệu chƣa công bố).
Kết quả từ các nghiên cứu proteomics đối với mẫu huyết thanh của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đã cho chúng ta thấy những protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học trong chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng. Bên cạnh đó, hƣớng nghiên cứu proteomics đối với mẫu nƣớc tiểu cũng đã đƣợc các nhà khoa học quan tâm. Theo một nghiên cứu của Ward và cs, các nhà khoa học đã sử dụng kỹ thuật SELDI và MALDI để phân tích proteomics trên 67 mẫu nƣớc tiểu của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và 72 mẫu nƣớc tiểu của ngƣời bình thƣờng. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 19 đỉnh có mƣ́ c độ khác biệt giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng. Ứng dụng các protein này để nhận dạng ung thƣ đại trực tràng có độ nhạy là 78% và độ đặc hiệu là 87%. Tác giả cũng kết luận rằng sự thay đổi hệ protein trong mẫu nƣớc tiểu cũng có thể hỗ trợ chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng ở giai đoạn sớm [40].
Phân tích proteomics mẫu mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng
Cùng với nghiên cứu proteomics huyết tƣơng, để tìm hiểu một cách chính xác hơn về các protein đặc trƣng liên quan đến bệnh, chúng ta cần phân tích trực tiếp protein tƣ̀ các tế bào của khối u đại trực tràng. Hơn nữa, hầu hết các chỉ thị sinh học cho ung thƣ đƣợc phát hiện bằng cách sử dụng chính những mô của căn bệnh này [14].
24
Với mục đích nghiên cứu, tìm kiếm chỉ thị sinh học cho ung thƣ đại trực tràng, năm 2005, Alfonso và cs đã tiến hành phân tích proteomics ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng nhờ kỹ thuật 2D-PAGE kết hợp MS. Nghiên cứu đƣợc tiến hành với mẫu mô tại vị trí khối u và đối chứng là mẫu mô tại vị trí cận khối u của 7 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Nghiên cứu đã chỉ ra 72 protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ và mô bình thƣờng. Nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt bằng phân tích khối phổ đã xác định đƣợc 41 protein. Các protein khác biệt liên quan đến quá trình điều hòa phiên mã, các protein tín hiệu (annexins IV và V, relaxin, APC), các protein tham gia tổ chức khung xƣơng tế bào (vimentin, cytokeratins, beta actin) và các protein liên quan đến quá trình tổng hợp và cuộn gập protein (HSP 60, cathepsin D, RSP4, calreticulin) [6].
Nghiên cứu của Bai và cs sƣ̉ du ̣ng kỹ thuật điện di 2 chiều kết hợp với khối phổ, thƣ̣c hiê ̣n trên mẫu mô tại vị trí khối u đại trực tràng (mẫu bệnh) và mẫu mô tại vị trí gần khối u (mẫu đối chứng) trên cùng một bệnh nhân. Mẫu mô đại trực tràng từ 12 bệnh nhân đã đƣợc sử dụng cho nghiên cứu này. Kết quả điện di 2 chiều cho thấy có 60 protein biểu hiện khác biệt (hàm lƣợng chênh lệch 1,5 lần) giữa mô ung thƣ và mô thƣờng. Tiếp tục tiến hành phân tích khối phổ để nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt, 10 protein đã đƣợc nhận dạng, bao gồm 2 protein biểu hiện giảm và 8 protein biểu hiện tăng ở mô ung thƣ. 2 protein biểu hiện giảm ở mô ung thƣ bao gồm carbonic anhydrase II và protein disulfide isomerase. 8 protein biểu hiện tăng ở mô ung thƣ bao gồm APC-stimulated guanine nucleotide exchange factor, phosphoglycerate kinase 1, fumarate hydratase, aldolase A, activator protein 2B, glutathione S-transferase A3, Arginase và zinc finger protein 64 homolog. Những protein biểu hiện khác biệt này đƣợc cho là có liên quan đến quá trình phát triển của khối u [8].
Phƣơng thức chuyển hóa các chất trong tế bào ung thƣ đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành, phát triển ung thƣ. Nhằm tìm hiểu sự thay đổi trong con đƣờng chuyển hóa các chất của tế bào ung thƣ đại trực tràng, năm 2006, Xuezhi và cs đã tiến hành nghiên cứu nhằm tìm ra sự biến đổi trong thành phần
25
protein liên quan đến các con đƣờng chuyển hóa các chất trong tế bào ung thƣ. 7 cặp mô ung thƣ đại trực tràng và mô lân cận u (đối chứng) đƣợc sử dụng cho nghiên cứu. Dịch chiết protein từ mô ung thƣ và mô bình thƣờng đƣợc phân tách trên bản điện di hai chiều, pH 7-10. Khi so sánh sự biểu hiện của các spot protein trên bản gel mô ung thƣ và mô bình thƣờng, các nhà khoa học xác định đƣợc 34 spot protein với mƣ́ c độ biểu hiện khác biệt mang ý nghĩa thống kê. 16 trong số 34 spot đã đƣợc nhận dạng bằng MALDI – TOF/TOF. Sự biểu hiện tăng cƣờng của các protein tham gia quá trình phân giải đƣờng nhƣ aldolase A, anolase 1, GAPDH... cho thấy có sự xuất hiện của tác động Warburg đối với ung thƣ đại trực tràng. Trong khi đó, một protein quan trọng trong quá trình tổng hợp glucose lại có biểu hiện giảm, đó là protein phosphoenolpyruvate carboxykinase. Sự biểu hiện giảm của 2 protein là UDP-glucose 6-de-hydrogenase (UGDH) và UDP-glucose pyrophosphorylase 2 có thể dẫn đến ức chế quá trình đồng hóa acid gluconic. Kết quả nghiên cứu cũng đƣa ra sự biểu hiện giảm của các protein tham gia vào bƣớc khởi đầu của chu trình tricarboxylic acid (aconitase và aconitate hydratase) và sự biểu hiện tăng lên của các enzyme tham gia vào bƣớc cuối cùng của chu trình này (malate dehydrogenase), chứng tỏ có sự ức chế chu trình tricarboxylic acid trong tế bào ung thƣ đại trực tràng. Từ những kết quả thu đƣợc chứng tỏ có sự biến đổi lớn trong con đƣờng chuyển hóa các chất đối với ung thƣ đại trực tràng [38Error! Reference source not found.].
Ngoài việc tìm kiếm các chỉ thị sinh học nhằm ứng dụng trong chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng, các nhà khoa học còn đi sâu tìm hiểu cơ chế tác dụng của các biện pháp điều trị ở mức độ phân tử. Năm 2004, Allas và cs đã công bố kết quả nghiên cứu các protein liên quan đến tính chịu bức xạ của ung thƣ đại tràng, mục đích cuối cùng là dự đoán mức độ phản ứng của khối u với biện pháp xạ trị. 17 bệnh nhân tham gia trong nghiên cứu đều đƣợc chẩn đoán mắc ung thƣ trực tràng. Các khối u đƣợc sinh thiết trƣớc khi tiến hành xạ trị. Sau đó, tất cả các bệnh nhân đƣợc xạ trị bằng 1 liều đầy đủ (tƣơng đƣơng với 50 Gray). Phẫu thuật đƣợc tiến hành 6 tuần sau đó và kết quả đáp ứng với bức xạ đƣợc đánh giá bằng giải phẫu mô học.
26
Kết quả nghiên cứu cho thấy có 7 bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn, 7 bệnh nhân đáp ứng 1 phần và 3 bệnh nhân còn lại chƣa đƣợc đánh giá. Tiếp tục tiến hành phân tích proteomics đối với mẫu mô từ các khối u có đáp ứng với xạ trị khác nhau, sử dụng kỹ thuật điện di 2 chiều kết hợp với phân tích MALDI – TOF MS đã xác định đƣợc một số protein liên quan đến khả năng chịu bức xạ của mô ung thƣ, bao gồm tropomodulin, heat shock protein 42, beta-tubulin, annexin V, calsenilin và một số protein liên quan đến tính nhạy bức xạ bao gồm keratin type I, notch 2 protein homolog và protein sửa chữa ADN RAD51L3 [7].
Hệ protein mô ung thƣ đại trực tràng trong các giai đoạn bệnh khác nhau sẽ có mức độ biểu hiện khác nhau. Nghiên cứu proteomics đối với các mẫu mô ung thƣ ở các giai đoạn bệnh khác nhau sẽ giúp tìm ra những chỉ thị sinh học ứng dụng