Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng các thiết bị, dụng cụ trong Phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein. Các thiết bị chính bao gồm:
Máy ly tâm lạnh 5417R (Eppendorft, Đức), máy ly tâm K30 (Sigma, Đức). Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad - Mỹ), Ettan IPGphor 3
(GE Healthcare, Mỹ).
Thanh IPG strip pH 3-10, dài 17 cm (Biorad, Mỹ).
Buồng điện di: Protean II xi multi-cell cho phép chạy 6 bản gel 17cm cùng một lúc, Protean II XL cell chạy 2 bản gel kích thƣớc 17cm và Mini-Protean 3 cell (Biorad - Mỹ) chạy các gel kích thƣớc 7cm.
Nguồn điện di PowerPacTM
HC (Biorad - Mỹ).
Hệ thống phần mềm chuyên dụng phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều Phoretix (Shimadzu - Nhật Bản).
Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA - CRFPLUS
(KRATOS - Anh). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xử lý mẫu mô đại trực tràng
Mẫu mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đƣợc lấy ra từ tủ -80o
C, rã đông. Cân 2 mẫu mô với lƣợng tƣơng đƣơng (khoảng 0,1g) cho vào hai cối sứ riêng biệt để trên đá. Quy trình xử lý mẫu mô đại trực tràng đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Bước 1. Thu các phân đoạn dịch chiết protein
Mẫu mô đƣợc cắt nát bằng kéo cho đến khi mẫu nát nhỏ. Bổ sung 100 µl đệm muối phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4. Chuyển toàn bộ mẫu mô đã cắt và dịch
30
đệm vào ống eppendorft để trong 30 phút, ở 4oC. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C để thu dịch nổi là phân đoạn PBS 1.
Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 1 đƣợc bổ sung 200µl đệm PBS 0,05M, pH 7,4 để ở 4o
C trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu dịch nổi là phân đoạn PBS 2.
Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 2 đƣợc hòa tan bằng 100 µl đệm lysis (Urea 7M, Tris 30mM, CHAPS 4% và DTT 65mM), để ở 4oC trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 1.
Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 3 đƣợc hòa tan bằng 100 µl đệm lysis, để ở 4o
C trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 2.
Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 4 đƣợc hòa tan bằng 200 µl đệm lysis, để ở 4o
C trong 60 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 3.
Bước 2. Loại mỡ trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được
Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu đƣợc (PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2 và lysis 3) ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC và hút loại lớp mỡ phía trên. Bƣớc loại mỡ đƣợc lặp lại ít nhất 2 lần để đảm bảo loại mỡ tối đa.
Bước 3. Loại cặn tế bào, ADN, ARN trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được
Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu đƣợc sau quá trình loại mỡ ở tốc độ 60.000g trong 30 phút ở 4oC, thu dịch nổi phía trên, loại bỏ cặn. Bƣớc này đƣợc lặp lại 2 lần để đảm bảo loại cặn tối đa.
Bước 4. Kiểm tra thành phần protein có trong các phân đoạn chiết và độ sạch của mẫu
31
Dịch chiết protein thu đƣợc từ các phân đoạn sẽ đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành phần protein có trong mẫu và độ sạch của mẫu. Các mẫu chƣa đạt độ sạch sẽ đƣợc tủa bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100%, để ở -20oC trong ít nhất 2 tiếng đến qua đêm. Các protein lắng tủa đƣợc thu lại sau khi ly tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút, ở 4o
C trong thời gian 10 phút sẽ đƣợc hòa tan lại bằng đệm lysis. Kết quả làm sạch mẫu dịch protein bằng phƣơng pháp tủa cũng đƣợc kiểm tra bằng cách điện di dung dịch sau khi hòa tủa trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Các dịch chiết của cùng một mẫu đƣợc trộn lại để chuẩn bị cho điện di hai chiều.
2.2.2. Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford
Để đảm bảo hàm lƣợng protein tổng số giữa các mẫu nghiên cứu là tƣơng đƣơng nhau, trƣớc khi điện di hai chiều, chúng tôi tiến hành định lƣợng protein trong mẫu dịch chiết protein từ mô ung thƣ và mô bình thƣờng bằng phƣơng pháp Bradford. Phƣơng pháp này giúp định lƣợng protein trong mẫu nghiên cứu dựa trên nguyên tắc so màu. Các protein khi phản ứng với thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue sẽ hình thành một hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 595nm. Cƣờng độ màu tỷ lệ với nồng độ protein có trong dung dịch [26Error! Reference source not found.]. Chúng tôi sử dụng albumin huyết thanh bò với nồng độ đã đƣợc biết trƣớc để xây dựng đƣờng chuẩn về độ hấp thụ ánh sáng ở các nồng độ khác nhau. Các mẫu sẽ lần lƣợt đƣợc tiến hành đo, xác định độ hấp thụ ánh sáng, từ đó tính toán ra nồng độ protein có trong dung dịch.
Sau khi đã xác định hàm lƣợng protein có trong mẫu, chúng tôi tiến hành tính toán sao cho hàm lƣợng protein có trong dung dịch sử dụng cho điện di hai chiều của mẫu bệnh và mẫu đối chứng là tƣơng đƣơng nhau.
2.2.3. Điện di hai chiều
Kỹ thuật điện di hai chiều đƣợc sử dụng để phân tách các protein trong mẫu thành các điểm riêng rẽ, trong đó chiều điện di thứ nhất là điện di phân vùng đẳng điện (IEF) để phân tách các protein theo điểm đẳng điện (pI) và chiều điện di thứ
32
hai là điện di SDS-PAGE để phân tách protein theo khối lƣợng và hình dạng. Quá trình này đƣợc bắt đầu bằng việc làm trƣơng thanh strip có gradient pH cố định bằng đệm trƣơng gel có chứa protein. Sau 1,5 giờ dung dịch sẽ ngấm vào thanh strip. Lƣợng protein tối đa mà sợi gel IPG strip pH 3 - 10 dài 17cm có thể thấm đƣợc là 400µg.
Điện di đẳng điện đƣợc thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell hoặc Ettan IPGphor3 để tập trung các phân tử protein vào vị trí tƣơng ứng với pI của phân tử đó trên thanh IPG strip. Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 5 bƣớc đƣợc trình bày trong bảng 3.
Bảng 3. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm
Bƣớc Hiệu điện thế V Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng U
Bƣớc 1 50 12 giờ … Trƣơng gel
Bƣớc 2 125 2 giờ … Tuyến tính
Bƣớc 3 250 15 phút … Nhanh
Bƣớc 4 10.000 2 giờ … Chậm
Bƣớc 5 10.000 … 40.000 Vh Nhanh
Tổng ≈ 20 giờ ≈ 60.000
Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh strip đƣợc ngâm trong đệm cân bằng I (Tris HCl 50mM, pH 8,8; Urea 6M; glycerol 30%; SDS 2%; DTT 0,1%) ở nhiệt độ phòng và đệm cân bằng II (Tris HCl 50mM, pH 8,8; Urea 6M; glycerol 30%; SDS 2%; IAA 0,25%) thực hiện trong bóng tối cũng ở nhiệt độ phòng. Mỗi bƣớc cân bằng đƣợc thực hiện 3 lần, thời gian mỗi lần theo thứ tự là: 5 phút, 10 phút, 10 phút. Điện di chiều hai đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Kết thúc điện di chiều hai, các protein đƣợc cố định 45 phút trong dung dịch chứa axít phosphoric 1,3%, methanol 20%, sau đó nhuộm bằng dung dịch Coomassie G250 qua đêm theo phƣơng pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff
33
(1988). Phƣơng pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein [43].
2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều
Đầu tiên bản gel điện di hai chiều đƣợc quét vào máy tính có phần mềm phân tích chuyên dụng Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản). Bƣớc đầu phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và đánh số thứ tự cho các spot. Tiếp đó, phần mềm Phoretix sẽ xác định vị trí, thể tích của từng spot và giá trị cƣờng độ khối trung bình của mỗi spot trên bản gel (đƣợc tính bằng thể tích của spot đó chia cho tổng thể tích các spot trên toàn bản gel nhân với 100) từ đó giúp chỉ ra các spot tƣơng ứng trên từng bản gel và các spot có biểu hiện khác biệt giữa bản gel mẫu bệnh so với bản gel mẫu đối chứng (hình 3).
Hình 3. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix
Kết quả phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều chỉ ra các spot protein xuất hiện trên bản gel này mà không xuất hiện trên bản gel kia hay các spot biểu hiện tăng, giảm khác nhau giữa hai bản gel mô ung thƣ và bản gel đối chứng. Dựa vào kết quả này, chúng tôi xác định đƣợc các spot protein quan tâm để tiến hành phân tích tiếp theo.
34
2.2.5. Cắt và thủy phân spot
Các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai chiều đƣợc cắt ra khỏi bản gel. Lúc này các phân tử protein nằm trong gel polyacrylamide liên kết với phân tử thuốc nhuộm Coomassie. Do đó, trƣớc tiên cần phải loại bỏ chất màu Coomassie. Protein trong các spot đƣợc thủy phân thành các peptide để chuẩn bị cho phân tích khối phổ. Loại enzyme đƣợc sử dụng để thủy phân protein là trypsin. Enzyme này có tác dụng cắt phân tử protein tại các gốc Lysine (K) và Arginine (R) ở đầu C và không cắt khi các gốc này liên kết với Prolin (P). Khi đó, phân tử protein đƣợc cắt thành các mảnh peptide có kích thƣớc từ 6 – 20 acid amin, thích hợp cho phân tích khối phổ về sau [1]. Quá trình tẩy màu các spot, thủy phân protein thành các mảnh peptide sẵn sàng cho phân tích khối phổ bao gồm các bƣớc cụ thể nhƣ sau:
- Cắt spot ra khỏi bản gel. - Rửa spot bằng nƣớc Mini Q.
- Tẩy màu spot bằng dung dịch chứa ammonium bicarbonate (ABC) 50mM, acetonitrile (AcCN) 50%.
- Làm khô spot bằng AcCN 100%.
- Ủ spot protein với dung dịch enzyme trypsin hoạt động qua đêm ở 37o
C để enzyme cắt hoàn toàn phân tử protein thành các mảnh peptide, chui ra khỏi gel polyacrylamide và đi vào dịch thủy phân.
Các peptide trong dịch thủy phân sẽ đƣợc hấp phụ bằng Ziptip C18 theo quy trình sau:
- Làm ƣớt Ziptip bằng dung dịch có trifluoroacetic acid (TFA) 0,1% trong AcCN 70%.
- Cân bằng Ziptip bằng dung dịch chứa TFA 0,1 %. - Hấp phụ peptide trong dịch thủy phân vào Ziptip.
35 - Loại muối bằng TFA 0,1%.
- Thôi peptide ra khỏi Ziptip lên đĩa MS bằng dung dịch TFA 0,1% trong AcCN 70%.
- Cuối cùng, bổ sung lên đĩa MS dung dịch chất nền (CHCA 10mg/ml trong TFA 0,05%, AcCN 50%).
2.2.6. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein
Tiến hành phân tích khối phổ MALDI – TOF MS để xác định khối lƣợng của tập hợp các peptide thu đƣợc sau quá trình thủy phân các spot protein bằng enzyme trypsin. Phƣơng pháp khối phổ (MS) là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện hay ion trong một điện trƣờng hoặc một từ trƣờng nhất định. Nguồn MALDI đƣợc dùng trong phân tích các hợp chất cao phân tử dựa trên nguyên lý làm ion hóa và thăng hoa mẫu peptide từ phức hợp chất nền (matrix) ở dạng tinh thể qua tác động của các xung laser [1].
Mẫu peptide đƣợc phân tích đồng thời với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai peptide Angiotensin II (Mw 1046,54 Da) và Insulin B (Mw 3494,65 Da). Hỗn hợp peptide đƣợc trộn với chất nền CHCA, để khô và đƣa vào máy phân tích khối phổ AXIMA – CRFPLUS. Các thông số cài đặt bao gồm:
- Nguồn laser: 55
- Profile: 30 profile cho 1 lần bắn - Khối lƣợng tối ƣu: 2.000 Da - Phổ khối lƣợng: 500 – 5.000 Da
Protein đƣợc nhận dạng bằng phƣơng pháp PMF (Peptide Mass Fingerprint). Phƣơng pháp này nhận dạng protein bằng việc so sánh khối lƣợng của tập hợp các peptide thu sau khi thủy phân với cơ sở dữ liệu có sẵn, sử dụng phần mềm Mascot với chế độ tra cứu nhƣ sau:
36 - Cơ sở dữ liệu: NCBI
- Phân loại: Homo sapiens
- Enzyme: Trypsin
- Các cải biến không thay đổi: Cacbamidomethyl (C) - Các cải biến thay đổi: Oxidation (M)
- Giá trị khối: MH+
37
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tách chiết protein từ mô ung thƣ đại trực tràng (mẫu bệnh) và mô đại trực tràng bình thƣờng (mẫu đối chứng) của cùng một bệnh nhân. Mẫu mô đƣợc cắt nhỏ, ngâm trong đệm PBS 0,05M, pH 7,4 và đệm phá tế bào lysis rồi thực hiện các bƣớc ly tâm để thu lấy các phân đoạn dịch chiết protein. Kết quả tách chiết đƣợc kiểm tra bằng điện di SDS - PAGE (hình 4).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 4. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng trên cùng bản gel polyacrylamide 10% có SDS
Giếng 1, 2, 3, 4, 5: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2, lysis 3 thu được từ mô đại trực tràngbình thường.
Giếng 6, 7, 8, 9, 10: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2, lysis 3 thu được từ mô ung thư đại trực tràng.
Trong điê ̣n di SDS - PAGE, các protein đƣợc phân tách theo khối lƣợng phân tử, các protein có khối lƣợng phân tử khác nhau thì đƣợc hiện lên dƣới dạng từng vạch băng khác nhau. Hiệu quả tách chiết protein đƣợc đánh giá thông qua số lƣợng các băng và độ đậm nhạt của các băng. Khi nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm có chứa Coomassie, băng protein bắt màu thuốc nhuô ̣m càng đâ ̣m chƣ́ng tỏ hàm lƣợng protein loa ̣i đó càng lớn . Số lƣợng băng trong mô ̣t giếng điê ̣n di càng nhiều , thành phần protein của mẫu càng đa dạng phong phú . Ngoài ra, kết quả điện di SDS –
38
PAGE còn bị ảnh hƣởng bởi các thành phần không phải là protein nhƣ mỡ, cặn tế bào, ADN, ARN… Khi có mặt của những thành phần này trong dịch chiết, kết quả điện di sẽ xuất hiện những vệt dọc, kéo dài và bắt màu đậm với thuốc thuộm.
Hình 4 cho thấy kết quả điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết thô protein từ mẫu mô đại trực tràng. Nhìn vào kết quả điện di chúng tôi thấy trong các giếng đã xuất hiện nhiều băng protein trải đều từ trên xuống dƣới chứng tỏ đã tách chiết thành công protein từ mô đại trực tràng và thành phần protein thu đƣợc trong mẫu là đa dạng và phong phú. Trong các mẫu, phân đoạn PBS 2, lysis 2 và lysis 3 (giếng số 2, 4, 5 và 7, 9, 10) có các băng vạch rõ nét và không có hoặc ít có vệt kéo dài từ trên xuống dƣới. Điều này chứng tỏ các phân đoạn này là tƣơng đối sạch, ít bị lẫn các thành phần phi protein. Bên cạnh đó, các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 (giếng số 1, 3 và 6, 8) của các mẫu có các băng protein hiện lên chƣa rõ ràng và xuất hiện hiện tƣợng kéo vệt dọc theo chiều dài giếng. Điều này chứng tỏ các phân đoạn này có thể lẫn các thành phần phi protein trong mẫu. Do đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu của các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100% ở -20oC. Protein sau khi tủa đƣợc hòa tan lại bằng chính đệm lysis và đƣợc điện đi kiểm tra trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Kết quả điện di kiểm tra mẫu tủa đƣợc cho trong hình 5.
39
Hình 5. Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1 từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng trên bản gel
polyacrylamide 10% có SDS
Giếng 1, 2,: Lần lượt là mẫu tủa của các phân đoạn dịch chiết PBS 1, lysis 1 thu được từ mô đại trực tràngbình thường.