2.2.1. Phƣơng phỏp chiết xuất và tinh chế cỏc carotenoid
- Sấy khụ:
Trƣớc tiờn, cỏc mẫu thực vật đƣợc thu hỏi ở Thành phố Hà Nội, đƣợc định loại bởi PGS.TS Trần Ninh (Khoa Sinh học, Trƣờng ĐH KHTN); đƣợc rửa sạch, đem sấy ở 600C đến khối lƣợng khụng đổi, tỏn thành bột mịn.
32
- Ngõm chiết:
Lƣợng 10gr bột khụ mẫu thực vật đƣợc trộn đều với 100ml dung mụi ether dầu hỏa (acetone), ngõm trong bỡnh kớn, tối màu, qua đờm (24-48h). Dung dịch ngõm đƣợc lọc qua phễu cú giấy lọc để thu dịch trong, đem cụ bằng hệ thống cụ quay thu hồi dung mụi để thu cao chiết.
Lutein, là một carotenoid cú oxi, nú lại khụng tồn tại trong thực vật ở dạng tự do mà là dạng ester với palmitic acid. Vỡ thế, quỏ trỡnh tỏch chiết của chỳng tụi phức tạp hơn đối với beta-carotene và lycopene, cú thờm bƣớc thủy phõn lutein ester bằng KOH rồi trung hũa lại bằng HCl.
- Sắc ký bản mỏng:
Sau khi thu đƣợc cao chiết, chỳng tụi tiến hành làm sắc kớ bản mỏng trờn silicagel để xỏc định xem những mẫu nào chứa nhiều những chất chỳng tụi tỡm kiếm. Đõy là một bƣớc sàng lọc rất hiệu quả để chọn cỏc đối tƣợng chứa nhiều carotenoid.
Lƣợng 0,1gr cao khụ cỏc mẫu thực vật đƣợc hũa tan lại với 1ml hệ dung mụi sắc ký bản mỏng (hệ 1,2,3 nhƣ trờn bảng 2.2) rồi đem ly tõm ở 4 0C để loại bỏ cặn khụng tan, thu lại cao bằng bốc hơi cỏch thủy. Cao đƣợc hũa tan lại với 1ml dung mụi sắc ký để chấm lờn bản sắc ký silicagel trỏng sẵn.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao:
Từ những đỏnh giỏ ban đầu về hàm lƣợng carotenoid bằng sắc ký bản mỏng, cỏc mẫu cú nhiều carotenoid sẽ đƣợc tiếp tục nghiờn cứu bằng sắc kớ lỏng hiệu năng cao, đõy là một phƣơng phỏp hiện đại để phỏt hiện đồng thời nhiều chất và xỏc định thành phần, hàm lƣợng cỏc chất cú trong mẫu.
Pha động: acetonitrine:methanol:chloroform = 55:23:22 (v/v/v). Tốc độ dũng 0,85 ml/phỳt, thời gian chạy 20 phỳt, pH 2-8, nhiệt độ 300C.
Trong điều kiện phõn tớch sắc ký với pha động, tốc độ dũng, pha tĩnh, nhiệt độ... cố định đó đƣợc chọn, đại lƣợng đặc trƣng cho một chất là thời gian lƣu Rt của chất đú trờn cột tỏch. Vỡ thế, ta cú thể phõn tớch định tớnh cỏc chất trong mẫu bằng HPLC thụng qua thời gian lƣu mẫu chuẩn của chất đú.
33
Để phõn tớch định lƣợng cỏc chất, chỳng ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao hoặc diện tớch pớc, ở đõy, chỳng tụi sử dụng số liệu diện tớch pớc.
Trƣớc tiờn, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt lập đƣờng chuẩn của cỏc carotenoid (beta-carotene, lycopene và lutein) trong cựng nồng độ từ 0,1 – 3,0 ppm.. Chất chuẩn đƣợc kiểm tra lại bằng HPLC và lập đƣờng chuẩn cho mỗi đợt phõn tớch, trỏnh trƣờng hợp carotenoid bị phõn giải khi cất giữ. Dựa vào số liệu diện tớch cỏc pớc, chỳng tụi sử dụng phần mềm LC Solution Version 10.1 để xõy dựng đƣờng chuẩn. Từ đú, chỳng tụi tớnh đƣợc hàm lƣợng của cỏc carotenoid trong cỏc mẫu nghiờn cứu. Sau đõy là đƣờng chuẩn của β-carotene, lycopene và lutein.
Phƣơng trỡnh y=ax+b: Thụng số Giỏ trị Sai số a 231724,7 1649,86 b 1831,23 2707,42 N 7 P <0,0001 Hỡnh 2.1 Đƣờng chuẩn β-carotene
34 Phƣơng trỡnh y=ax+b: Thụng số Giỏ trị Sai số a 186996,34 1203,11 b -5414,38 1899,02 N 7 P <0,0001 Hỡnh 2.2 Đƣờng chuẩn lycopene Phƣơng trỡnh y=ax+b: Thụng số Giỏ trị Sai số a 231724,7 1649,86 b 183130,23 2707,42 N 7 P <0,0001 Hỡnh 2.3 Đƣờng chuẩn lutein
Lƣợng 1mgr cao cỏc mẫu thực vật đƣợc hũa tan trong 1ml hệ dung mụi HPLC (hệ dung mụi 4 ở bảng 2.2) để chuẩn bị dịch lờn cột HPLC. Dựa vào diện tớch cỏc pớc trong mẫu nghiờn cứu, hàm lƣợng cỏc carotenoid (beta-carotene, lycopene và lutein) sẽ đƣợc tớnh toỏn theo phƣơng trỡnh đƣờng chuẩn, bằng phần mềm chuyờn dụng LC Solution Version 10.1. Kết quả đƣợc trỡnh bày trong bảng hàm lƣợng cỏc carotenoid, phụ lục 4.
35
- Sắc ký cột lọc gel:
Cỏc mẫu chứa nhiều beta-carotene, lycopene và lutein sẽ tiếp tục đƣợc chỳng tụi thu với khối lƣợng nhiều hơn để tỏch chiết và tinh chế. Bƣớc đầu, chỳng tụi dựng phƣơng phỏp sắc kớ bản mỏng điều chế để thu đƣợc một lƣợng cao tinh sạch. Tiếp đến, chỳng tụi sử dụng sắc kớ cột silicagel để thu đƣợc cỏc phõn đoạn carotenoid tinh sạch.
Cột lọc gel Pharmacia Biotech chiều dài 40 cm, đƣờng kớnh 1,5 cm. Pha tĩnh là hạt silicagel (Merck) cú kớch thƣớc 0,063 x 0,2 mm. Pha động là hệ dung mụi rửa giải ether dầu hoả : acetone đƣợc pha theo tỷ lệ tƣơng ứng 90:10. Nhiệt độ: 30 0C.
Cõn 20 g silicagel ngõm trong hệ dung mụi rửa giải trong 24 giờ, sử dụng để nhồi cột.
Mẫu đƣa lờn cột đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: cõn 2 gr mẫu cao thực vật, hoà tan với 10 ml ether dầu hoả : acetone (95/5, v/v), để lắng, sau 1 giờ lọc bỏ cặn thu phần dịch phớa trờn khoảng 8 ml. Tốc độ dũng chạy của bơm nhu động là 20 ml/giờ, thu mỗi phõn đoạn là 2 ml cho đến khi cỏc chất trờn cột đƣợc đẩy ra hết. Cỏc phõn đoạn đƣợc đo mật độ quang phổ với cỏc bƣớc súng hấp phụ cực đại tƣơng ứng với từng chất. Cỏc phõn đoạn cú cựng độ hấp phụ quang học giống nhau, giống với chất chuẩn đƣợc gộp lại thu đƣợc dịch chứa carotenoid tinh sạch. Dung dịch đƣợc đem bốc hơi cỏch thủy để thu carotenoid ở dạng tinh khiết, khụ, cú màu đặc trƣng.
Cỏc carotenoid sau khi đƣợc tinh chế, đƣợc khẳng định lại bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Sau đú, 3 mẫu carotenoid tinh chế (β-carotene từ lỏ gấc, lycopene từ quả cà chua và lutein từ cỏnh hoa cỳc vạn thọ) đƣợc đo phổ khối và phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn. Đõy là một cụng cụ rất mới và hiện đại để phỏt hiện cỏc hợp chất húa học, cú độ chớnh xỏc tuyệt đối.
Quỏ trỡnh sắc ký lọc gel đƣợc tiến hành nhiều lần để thu đƣợc lƣợng lớn carotenoid tinh khiết, để sử dụng cho cỏc nghiờn cứu hoạt tớnh sinh học tiếp theo.
- Ghi phổ khối cỏc carotenoid:
Khối phổ là một trong những phƣơng phỏp đƣợc sử dụng để xỏc định khối lƣợng phõn tử của cỏc chất nghiờn cứu dựa vào sự phỏt hiện ra ion phõn tử M+
36 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đú sẽ dẫn tới xõy dựng cụng thức phõn tử. Việc nghiờn cứu cỏc quỏ trỡnh phõn mảnh sẽ giỳp nhận biết một số đơn vị cấu trỳc của phõn tử.
- Ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhật 1H và 13C cỏc carotenoid:
Đõy là một trong những phƣơng phỏp nghiờn cứu hiện đại nhất để phõn tớch cấu trỳc cỏc hợp chất húa học. Phổ NMR là một loại phổ hấp thụ, đƣợc sinh ra bởi cỏc hạt nhõn nguyờn tử cú từ tớnh hấp thụ cỏc bức xạ điện từ khi nằm trong một từ trƣờng ngoài rất mạnh. Cỏc phổ NMR đƣợc sử dụng rộng rói nhất trong húa học hữu cơ là phổ của cỏc nguyờn tử 1H và 13C. Phổ NMR đƣợc đặc trƣng bởi hai thụng số là độ chuyển dịch húa học δ và hằng số tƣơng tỏc spin Ј. Hai thụng số này cú liờn quan chặt chẽ tới cấu trỳc phõn tử. Việc phõn tớch cỏc thụng số này đƣợc thực hiện bằng cỏc phộp đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn một chiều, cho phộp xỏc định bản chất, số lƣợng cỏc nguyờn tử H và C cú trong phõn tử. Cỏc phổ NMR một chiều thụng dụng nhất là phổ proton 1HMR, phổ carbon 13CMR và phổ APT, DEPT. Cỏc phổ NMR hai chiều cho phộp xỏc định trực tiếp cỏc tƣơng tỏc giữa cỏc hạt nhõn cú vị trớ gần nhau trong phõn tử. Cỏc phổ hai chiều đo những tƣơng tỏc của cỏc hạt nhõn cựng loại đƣợc gọi là phổ tƣơng tỏc đồng nhõn, cũn giữa cỏc hạt nhõn khỏc loại đƣợc gọi là tƣơng tỏc dị nhõn. Phổ đƣợc ghi bởi thiết bị AV 500MHz.
2.2.2. Nghiờn cứu hoạt tớnh chống oxy húa của cỏc carotenoid tinh sạch
Tỡm ra đƣợc nguồn nguyờn liệu chứa nhiều carotenoid là một hƣớng của chỳng tụi khi thực hiện đề tài này. Tuy nhiờn, nghiờn cứu cỏc hoạt tớnh sinh học của chỳng là phần quan trọng nhất của đề tài này. Qua đú ta thể cú thể đƣợc tỏc dụng cú lợi của cỏc carotenoid để ứng dụng vào cuộc sống.
Trƣớc tiờn, chỳng tụi tỡm hiểu khả năng chống oxy hoỏ thụng qua ảnh hƣởng của chế phẩm lờn hoạt tớnh của cỏc enzyme peroxidase và catalase huyết thanh mỏu ngƣời trong điều kiện in vitro.
- Xỏc định ảnh hưởng của chế phẩm đến hoạt độ enzyme peroxidase theo phương phỏp E.C Xavran [19]
37
Dựa trờn cơ sở xỏc định tốc độ phản ứng oxy hoỏ cơ chất indigocarmine bằng hydroperoxide trong mụi trƣờng acid yếu khi cú sự tham gia của peroxydase trong mỏu ngƣời. Peroxidase là enzyme oxy hoỏ cỏc chất hữu cơ khi cú mặt H2O2 ở nồng độ thấp.
Indigocarmine + H2O2 Indigocarmine + H2O + O2
(dạng khử màu xanh) (dạng oxy hoỏ màu vàng)
Hoạt độ của enzyme đƣợc xỏc định bằng thời gian oxy hoỏ hết indigocarmine, dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu vàng.
Phản ứng đƣợc tiến hành trờn cả 4 nhúm mỏu A, B, AB, O của ngƣời.
Tiến hành: 2 ml dung dịch đệm acetate 0,2N, pH 4,7 2 ml chế phẩm với cỏc nồng độ khỏc nhau 3 ml mỏu ngƣời pha loóng 500 lần
1 ml indigocarmine 0,001N 2 ml H2O2 0,2%
Lắc đều và đỏnh dấu thời gian phản ứng bằng đồng hồ bấm giõy kể từ khi bắt đầu cho H2O2 vào bỡnh phản ứng đến khi chuyển hết màu xanh sang màu vàng thỡ phản ứng kết thỳc.
- Xỏc định ảnh hưởng của chế phẩm đến hoạt độ enzyme catalase theo phương phỏp Bach và Zubkova [19]
Catalase phõn giải H2O2 thành H2O và O2. Lƣợng H2O2 thừa đƣợc chuẩn độ bằng KMnO4 trong mụi trƣờng acid. Phản ứng tiến hành theo phƣơng trỡnh:
2H2O2 2H2O + O2
2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O + 5O2
Chế phẩm cú khả năng phản ứng với H2O2 tạo thành sản phẩm oxy húa, do đú đó cạnh tranh cơ chất H2O2 với enzyme catalase. Phản ứng đƣợc tiến hành trờn cả 4 nhúm mỏu A, B, AB, O của ngƣời.
Tiến hành: 8 ml chế phẩm với cỏc nồng độ khỏc nhau 6,4 ml mỏu ngƣời pha loóng 200 lần
catalase peroxidase
38
4 ml H2O2 0,05% 1,6 ml H2SO4 10%
Tổng thể tớch 20 ml, đem lắc đều sau 30 phỳt chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N. Hoạt độ catalase đƣợc tớnh bằng lƣợng KMnO4 tỏc dụng với lƣợng H2O2 cũn lại sau phản ứng.
Ngoài ra, chỳng tụi cũn nghiờn cứu sự thay đổi hoạt tớnh của 2 enzyme này ở mỏu và gan khi cho chuột uống CCl4, là một chất độc gõy tỏc hại lờn gan. Khi chuột bị gõy độc gan bằng CCl4, chỳng tụi cũng nghiờn cứu sự thay đổi của 2 enzyme gan là GOT, GPT và định lƣợng cytochrome b5.
- Xỏc định chỉ số GOT và GPT [22,128]
GOT hay cũn gọi AST, là một loại transaminase aspartate aminotransferase cũn GPT là ALT, alanine aminotransferase. Chỳng xỳc tỏc cho hai phản ứng
aspartate + alpha-ketoglutarate glutamate + oxaloacetate alanine + alpha-ketoglutarate glutamate + pyruvate (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chỳng là 2 enzyme đƣợc coi cú liờn quan chặt chẽ đến sự tổn thƣơng hoặc viờm nhiễm ở gan, mặc dự ngƣời ta khụng chỉ phỏt hiện nú ở trong gan mà cũn ở nhiều cơ quan khỏc nhƣ thận, tim. Khi gan bị tổn thƣơng, nồng độ cỏc enzyme này thƣờng tăng cao và chỉ khi hết những tổn thƣơng thỡ chỳng mới trở lại bỡnh thƣờng.
Hai enzyme này đƣợc phõn tớch tại phũng Húa sinh của Bệnh viện Medlatec.
- Định lượng hàm lượng cytochrome b5 [21,104]
Cytochrome b5 là một hemoprotein cú mặt trong hầu hết cỏc tế bào sinh vật, tham gia vào quỏ trỡnh oxy húa cho cơ thể. Trong tế bào cytochrome b5 gắn vào màng microsome và cú chức năng vận chuyển điện tử giữa NADH và phõn tử O2 trong màng microsome.
Thớ nghiệm này đƣợc tiến hành theo phƣơng phỏp của Schenkman và cs [104]. Dựa vào sự hấp phụ khỏc nhau giữa trạng thỏi khử và trạng thỏi oxy húa của NADH của cytochrome b5 ở bƣớc súng 427 nm, ở nhiệt độ phũng.
Tiến hành: Cho 0,5ml dịch thử (mỏu chuột pha loóng 10 lần) vào 5,5 ml đệm 100 mM sodium phosphate, pH 7,4. Chia hỗn hợp thành 2 ống, ống thử cho thờm
39
100 μl NADH 1 mg/ml. Chờ 10 phỳt và đo quang phổ ở bƣớc súng 427 nm và 500 nm. Cỏch tớnh: đụphaloang E E ml mM Ccytb ( 427 500) ) / ( 5
Trong đú, ∆E427, ∆E500 là chờnh lệch giữa độ hấp phụ của mẫu thử và mẫu đối chứng ở bƣớc súng 427nm, 500nm.
ε: ε427nm/ ε500nm = 112 mM-1
cm-1
- Thớ nghiệm chống oxy hoỏ của chế phẩm carotenoid lờn tế bào gan chuột
H2O2 khụng những là một gốc tự do phổ biến mà cũn là một chất chuyển hoỏ thƣờng xuyờn xuất hiện ở trong cỏc tế bào động vật, đƣợc tạo ra do cỏc phản ứng khử oxy sinh học. Tuy nhiờn, H2O2 cũng là nguyờn nhõn gõy ra sự hỡnh thành cỏc gốc tự do nội sinh khỏc (vớ dụ nhƣ HO.) thụng qua cỏc phản ứng oxy hoỏ khử khỏc nhau trong tế bào và điều đú ảnh hƣởng nghiờm trọng tới sự sống cũn của tế bào. Do đú, để kiểm chứng khả năng bảo vệ tế bào trƣớc cỏc tỏc nhõn oxy hoỏ và cỏc gốc tự do của cỏc hoạt chất tiềm năng, cỏc nhà nghiờn cứu đó sử dụng tế bào gan làm mụ hỡnh nghiờn cứu. Trong đú, tế bào gan với cỏc hệ enzyme khử độc nhƣ cỏc glutathione S-transferase (GSTs), NAD(P)H: (quinone-acceptor) oxidoreductase (QR), và UDP-glucuronsyltransferase ... luụn là cơ quan thải độc cho cơ thể, sẽ bị H2O2 tỏc động trực tiếp và hoạt chất cần kiểm tra sẽ đƣợc đƣa vào nhƣ chất bảo vệ. Nếu hoạt chất cú thể bảo vệ tế bào gan khỏi tỏc động của H2O2 sẽ đƣợc xem là cú hoạt tớnh chống oxy húa.
Tiến hành:
Tế bào gan chuột sẽ đƣợc phõn lập bằng Trypsin 1%. Sau khi đƣợc phõn lập, chỳng sẽ đƣợc đƣa vào đĩa thớ nghiệm 96 giếng với mật độ 1 x 104 tb/giếng để nuụi qua đờm trong tủ ấm 5% CO2, ở 37oC. Tế bào sau đú sẽ đƣợc ủ với cỏc hoạt chất ở cỏc nồng độ khỏc nhau trong 2h. Tiếp theo, 100 M H2O2 sẽ đƣợc đƣa vào mỗi giếng và để tỏc động trong 2h. Để xỏc định số tế bào gan sống sút sau tỏc động của H2O2 cũng nhƣ tỏc động bảo vệ của hoạt chất nghiờn cứu, MTT nồng độ 1 mg/ml (50 l/giếng) sẽ đƣợc đƣa vào cỏc giếng và ủ tiếp trong 4h ở 37oC. Loại bỏ toàn bộ
40
dịch nổi và đƣa vào mỗi giếng 100 l/giếng DMSO 100% và đo mật độ quang học của chất formazan tạo thành bằng mỏy Microplate Reader ở 492 nm. Tất cả thớ nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần để trỏnh sai số. Cỏc số liệu đƣợc xử lớ bằng phần mềm TableCurve 2D phiờn bản 4.0 để tớnh giỏ trị ED50.
2.2.3. Nghiờn cứu hoạt tớnh sinh học cỏc carotenoid lờn cỏc dũng tế bào ung thƣ
in vitro
- Phương phỏp thử độ độc tế bào lờn cỏc dũng tế bào ung thư (Cytotoxic assay) [110]
Phƣơng phỏp thử độ độc tế bào in vitro đƣợc Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute) xỏc nhận là phộp thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phỏt hiện cỏc chất cú khả năng kỡm hóm sự phỏt triển hoặc diệt cỏc tế bào ung thƣ ở điều kiện in vitro [22]. Đõy là một phƣơng phỏp khỏ mới ở Việt Nam. Thớ nghiệm tiến hành xỏc định hàm lƣợng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD) đo đƣợc khi thành phần protein của tế bào đƣợc nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giỏ trị OD tỉ lệ thuận với lƣợng SRB gắn với phõn tử protein, do đú lƣợng tế bào càng nhiều thỡ lƣợng protein càng nhiều, tƣơng dƣơng với OD càng cao. Thớ nghiệm đƣợc tiến hành cụ thể nhƣ sau:
- Trƣớc tiờn cỏc dũng tế bào ung thƣ đƣợc nuụi trong mụi trƣờng phự hợp cú bổ sung 10% huyết thanh phụi bũ FBS và cỏc thành phần cần thiết khỏc ở điều kiện 5% CO2, 370C. Tựy vào từng dũng tế bào nghiờn cứu cụ thể mà thời gian cú thể khỏc nhau.
- Cỏc chế phẩm carotenoid và chất đối chứng (10 μl) đƣợc pha trong DMSO 10%, đƣa vào cỏc giếng của khay 96 giếng.
- Trypsin húa tế bào thớ nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để đƣa về mật độ phự hợp.