2.2.1. Quy trình dự kiến
Hình 2.3. Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu Sản phẩm thực phẩm chức năng Sấy phun Sản phẩm phlorotannin khô Dịch chiết kỹ thuật Ly tâm Dịch chiết thô Xác định nhiệt độ chiết Chọn dung môi thích hợp Xác định tỉ lệ nguyên liệu : dung môi Rong nguyên liệu (khô)
Rửa sạch Cắt nhỏ (Băm nhuyễn) Cô đặc Chiết rút Lọc Thẩm tách
Xác định thời gian chiết
Xác định điều kiện cô đặc
Xác định thời gian ly tâm
- Xác định nồng độ sấy - Xác định chương trình sấy
Đánh giá sản phẩm : - Hoạt tính chống oxi hóa - Màu sắc cảm quan
Đánh giá hoạt tính: - Poly phenol tổng - Khả năng oxi hóa - Tính kháng khuẩn
Đánh giá hoạt tính: - Poly phenol tổng - Khả năng oxi hóa - Tính kháng khuẩn
Đánh giá các chỉ tiêu theo yêu cầu của thực phẩm chức năng (Cảm quan, hóa lý, vi sinh vật)
Giải thích quy trình - Rong nguyên liệu
Rong khô thu mua đã được xử lý và có nguồn gốc rõ ràng. Mẫu rong đã thu thập được rửa sạch các chất bẩn cơ học và phơi khô trong bóng râm.
Mục tiêu lựa chọn rong khô: Hàm lượng ẩm trong rong nhỏ góp phần ức chế sự phát triển của vi sinh vật sống trên rong, ức chế quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa trong rong, từ đó rong được bảo quản tốt hơn, đảm bảo cho quá trình thực hiện không gặp gián đoạn về vấn đề nguyên liệu. Đồng thời khi hàm lượng ẩm nhỏ, tốc độ trích ly tăng lên (do độ ẩm tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán).
- Rửa sạch:
Rong được rửa sạch nhằm loại bỏ tạp chất và muối bám dính trên rong, tạo điều kiện cho quá trình chiết và lọc được dễ dàng.
- Cắt nhỏ:
Sau khi rửa sạch, rong được làm ráo sơ bộ, rồi cắt hoặc băm nhỏ với kích thước thuận lợi cho quá trình chiết rút, mục đích là làm tăng diện tích tiếp xúc của rong nguyên liệu và dung môi, đồng thời phá vỡ cấu trúc tế bào rong, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi. Tuy nhiên, không nên xay hoặc nghiền rong quá nhỏ, bởi kích thước bột rong quá nhỏ sẽ làm cản trở quá trình lọc.
- Chiết rút:
Phlorotannin là hợp chất hữu cơ có khả năng tan trong một số dung môi phân cực và không phân cực. Các yếu tố dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết đều có ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của phlorotannin trong quá trình chiết. Vì vậy, tại công đoạn chiết, ta sẽ tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng chiết của phlorotannin.
+ Xác định ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa
Dung môi khảo sát: nước, methanol 50 %, ethanol 50 %, hexane, dichlomethane, buthanol, acetone, ethylaxetat. Tìm ra dung môi thích hợp. Lựa chọn dung môi theo 02 tiêu chí: Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa.
+ Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi
Khảo sát các tỉ lệ sau 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30; 1:35; 1:40; 1:45; 1:50 để xác định khả năng chiết rút của rong nguyên liệu vơí các lượng dung môi khác nhau, từ đó tìm ra tỉ lệ thích hợp nhất theo các tiêu chí: hoạt tính chống oxi hóa, khối lượng chất chiết, hàm lượng phlorotannin.
+ Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết.
Xác định nhiệt độ chiết hợp lý bằng cách khảo sát khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết ở các nhiệt độ khác nhau: 400C, 500C, 600C, 700C, 800C, 900C, 1000C, tìm ra nhiệt độ chiết thích hợp theo các tiêu chí: hoạt tính chống oxi hóa, khối lượng chất chiết, hàm lượng phlorotannin.
+ Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết.
Khảo sát các khoảng thời gian: 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 42h, 48h, 72h. Tìm ra thời gian chiết thích hợp theo 02 tiêu chí: hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa.
- Lọc:
Sau khi chiết rút, tiến hành lọc thu hồi các chất hòa tan được trong dung môi, loại bỏ tạp chất không tan (cặn, bã rong).
- Thẩm tách:
Thẩm tách nhằm loại bỏ lượng muối còn sót lại trong dịch rong, tạo điều kiện cho quá trình cô đặc và làm khô sau này.
- Cô đặc:
Cô đặc nhằm mục đích loại bỏ bớt dung môi trong dịch lọc nhờ quá trình bay hơi dung môi bởi nhiệt độ và áp suất, tạo điều kiện thuận lợi cho công đoạn sấy phun. Quá trình cô đặc phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian, chế độ khuấy đảo, áp suất của thiết bị,... Trong quá trình cô đặc, dung môi trong dịch rong bay hơi nên sẫm lại, thể tích dịch giảm dần. Nếu cô đặc ở điều kiện nhiệt độ và thời gian không thích hợp sẽ gây hao hụt hoặc làm biến tính chất tan cần chiết. Vì vậy, không nên cô đặc ở nhiệt độ quá cao và thời gian dài.
Xác định nhiệt độ cô đặc tối ưu: khảo sát tại các nhiệt độ: 400C, 500C, 600C, 700C. Tìm ra nhiệt độ thích hợp theo 2 tiêu chí: hoạt tính chống oxy hóa và màu sắc cảm quan.
- Ly tâm:
Ly tâm rong nhằm loại bỏ hết các tạp chất hoặc bã rong còn sót lại sau khi lọc và cô đặc. Bản chất của quá trình này là tách dễ dàng các phần tử khác nhau về kích thước và trọng lượng ( khối lượng riêng) trong dịch chiết, dưới tác dụng của lực ly tâm và trọng lực của Trái đất (lực ly tâm lớn hơn trọng lực rất nhiều).
Xác định thời gian ly tâm tối ưu: khảo sát tại các khoảng thời gian 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút với tốc độ 5000 vòng/phút. Các mẫu sau khi ly tâm đem đánh giá cảm quan.
- Sấy phun:
Sấy là quá trình tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng phương pháp nhiệt. Nhiệt được cung cấp cho vật liệu ẩm bằng dẫn nhiệt, đối lưu, bức xạ hoặc bằng năng lượng điện trường có tần số cao.
Mục đích của quá trình sấy tách triệt để toàn bộ dung môi còn lại trong dịch rong, lượng chất tan trong dịch tồn tại dưới dạng khô bột, tăng độ bền và bảo quản sản phẩm được lâu hơn.
Cần xác định điều kiện sấy phun sản phẩm:
+ Nồng độ chất khô: xác định tỉ lệ pha loãng của dung dịch sấy, khảo sát các tỉ lệ chất khô : cồn: 1:2; 1:3; 1:3,5; 1:4; 1:4,5; 1:5.
+ Chương trình sấy: khảo sát các mức lưu lượng phun của dung dịch sấy (l/giờ): 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5.
Tìm ra điều kiện sấy phun thích hợp theo 02 tiêu chí: Độ ẩm sản phẩm (%) và hiệu suất thu hồi (%).
2.2.2. Bố trí thí nghiệm
2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm lựa chọn dung môi chiết
Trong quá trình chiết, việc lựa chọn ra loại dung môi chiết thích hợp nhất để hòa tan tốt chất tan cần xác định là một yếu tố rất quan trọng. Qua bản chất của một số
loại dung môi và của chất tan, ta có thể khảo sát bằng một số loại dung môi có thể hòa tan phlorotannin là các dung môi: nước, methanol 50%, ethanol 50%, hexane, dichlomethane, acetone, buthanol, ethyl acetate.
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn dung môi chiết
Lựa chọn dung môi theo các tiêu chí: hoạt tính chống oxi hóa, tỉ lệ hàm lượng phlorotannin tổng/hàm lượng chất khô, từ đó lựa chọn dung môi chiết thích hợp.
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nguyên liệu : dung môi
Việc lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu : dung môi có ảnh hưởng lớn tới quá trình chiết. Nếu lượng dung môi quá ít, quá trình chiết sẽ không triệt để, lượng chất hòa tan bên trong nguyên liệu còn nhiều (do chênh lệch nồng độ chất tan nhỏ).
Ngược lại, nếu lượng dung môi quá lớn, khả năng chiết triệt để hơn, lượng chất tan hòa tan nhanh hơn, tuy nhiên, lại làm tăng chi phí dung môi và kéo dài thời gian thực hiện công đoạn cô đặc. Vì vậy cần lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu : dung môi sao cho thích hợp nhất.
Các tỉ lệ nguyên liệu : dung môi khảo sát: 1:10 ; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50
Dung môi chiết
Diclo metan Hexan
Methanol 50%
Nước Ethanol 50% Buthanol axetat Etyl
- Hoạt tính chống oxi hóa - Hàm lượng phlorotannin/chất chiết khô
Lựa chọn dung môi
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nguyên liệu : dung môi
Lựa chọn tỉ lệ thích hợp theo 03 tiêu chí: - Hoạt tính chống oxi hóa
- Khối lượng chất chiết khô - Hàm lượng phlorotannin tổng
2.2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả năng hòa tan các chất trong rong nguyên liệu vào môi trường chiết. Khi nhiệt độ tăng, các phân tử khuếch tán càng mạnh, độ nhớt giảm, lượng chất tan vào môi trường chiết càng nhiều.
Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao có thể làm biến tính một số hợp chất có hoạt tính sinh học hoặc làm hao hụt một lượng chất tan dễ bay hơi khác. Nếu nhiệt độ quá thấp, lượng chất tan khuếch tán ra môi trường bị hạn chế. Vì vậy cần xác định nhiệt độ chiết hợp lý.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết
1:15
- Hoạt tính chống oxi hóa - Khối lượng chất chiết khô - Hàm lượng phlorotannin tổng
Lựa chọn tỉ lệ thích hợp Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi
1:10 1:20 1:25 1:30 1:35 1:40 1:45 1:50
Nhiệt độ chiết
400C
- Hoạt tính chống oxi hóa - Khối lượng chất chiết khô - Hàm lượng phlorotannin tổng Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 1000C 900C 800C 700C 500C 600 C
Lựa chọn nhiệt độ chiết thích hợp theo 03 tiêu chí: - Hoạt tính chống oxi hóa
- Khối lượng chất chiết khô - Hàm lượng phlorotannin tổng
2.2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết
Thời gian chiết cần phải hợp lý bởi nếu kéo dài thời gian chiết, lượng chất hòa tan vào dung môi đã hết nhưng lại ảnh hưởng đến thời gian thực hiện và chi phí cho toàn bộ quá trình.
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết
Lựa chọn thời gian chiết thích hợp theo 02 tiêu chí: hoạt tính chống oxi hóa và hàm lượng phlorotannin/chất chiết khô
2.2.2.5. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện cô đặc tối ưu
Quá trình cô đặc là để tách bớt lượng dung môi có trong dịch chiết, tạo điều kiện thuận lợi cho các công đoạn sau. Ta cần xác định điều kiện nhiệt độ và thời gian cô đặc thích hợp nhằm hạn chế ảnh hưởng của 2 yếu tố này đến chất tan cần chiết.
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện cô đặc tối ưu
Lựa chọn nhiệt độ chiết thích hợp theo tiêu chí: hàm lượng phlorotannin tổng lớn nhất. Thời gian chiết
30h 24h
12h
6h 18h 48h 72h
- Hoạt tính chống oxi hóa - Hàm lượng phlorotannin/chất chiết khô
Lựa chọn thời gian
42h Nhiệt độ cô đặc 700C 600C 500C 400C Hàm lượng phenol tổng Lựa chọn nhiệt độ cô đặc tối ưu
2.2.2.6. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian ly tâm
Quá trình ly tâm là để tách hết cặn (bã rong) còn sót lại trong dịch chiết. Dịch chiết thu được sẽ trong hơn và sáng màu hơn. Ta cần xác định thời gian ly tâm thích hợp để tách triệt để cặn trong dịch rong đồng thời tiết kiệm được thời gian và chi phí thực hiện quá trình.
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ly tâm
Lựa chọn nhiệt độ chiết thích hợp theo tiêu chí: màu sắc cảm quan(độ trong , đục, màu sắc,…).
2.2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện sấy phun
Mục đích của quá trình sấy tách triệt để toàn bộ dung môi còn lại trong dịch rong, lượng chất tan trong dịch tồn tại dưới dạng khô bột. Máy sấy phun thông thường đòi hỏi nồng độ dung dịch là 30% và sử dụng dung môi là nước thì nhiệt độ buồng sấy là 80 - 900C. Cả 2 điều kiện này đều không áp dụng được với phlorotannin, vì chúng là polyme sinh học nên có độ nhớt cao và ở nhiệt độ cao sẽ giảm hoạt tính sinh học của chúng.
Để giảm nhiệt độ sấy của sản phẩm và tăng nồng độ dung dịch, đem pha loãng
dịch chiết (sau khi cô đặc) với cồn ethanol 90% tạo huyền phù và sau đó đem sấy phun. Chọn nhiệt độ buồng sấy là 600C tương ứng với nhiệt độ đầu ra là 400C. Để tìm ra một số thông số thích hợp đối với quá trình sấy sản phẩm sử dụng dung môi là cồn, khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng và lưu lượng phun của dung dịch sấy lên chất lượng của sản phẩm.
- Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng của dung dịch sấy
Để có nồng độ chất khô thích hợp, chọn điều kiện sấy như sau: lưu lượng phun
3 lít/giờ, nhiệt độ đầu vào 600C và đầu ra là 400C và khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng và hiệu suất thu hồi sản phẩm sau sấy.
Thời gian ly tâm
25 phút 20 phút 10 phút 5 phút 15 phút Màu sắc cảm quan (độ trong , đục, màu sắc,…)
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác tỉ lệ pha loãng của dung dịch sấy
- Ảnh hưởng của lưu lượng phun dung dịch sấy
Sau khi chọn được tỉ lệ pha loãng, tiến hành chọn lưu lượng phun thích hợp thông qua khảo sát ảnh hưởng của chúng lên độ ẩm và hiệu suất thu hồi sản phẩm.
Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác lưu lượng phun của dung dịch sấy 2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Các phương pháp phân tích hóa học và vật lý
- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy (Phụ lục 1)
- Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldadl (Phụ lục 1)
-Xác định hàm lượng lipid tổng bằng phương pháp Bligh và Dyer hỗn hợp chloroform/methanol. (Phụ lục 1)
- Xác định hàm lượng iod theo phương pháp chuẩn độ (Phụ lục 1)
- Xác định hàm lượng tro toàn phần bằng phương pháp trọng lượng (Phụ lục 1)
Tỉ lệ pha loãng tủa : cồn
1:4,5 1:4
1:3
1:2 1:3,5
- Độ ẩm sản phẩm (%)
- Hiệu suất thu hồi (%) Lựa chọn tỉ lệ tối ưu
1:5
Lưu lượng phun của dung dịch sấy (l/giờ)
4 3.5
2.5
2 3
- Độ ẩm sản phẩm (%)
- Hiệu suất thu hồi (%) Lựa chọn tốc độ tối ưu
- Xác định hàm lượng xơ thô theo Crudefibre và định lượng carbohydrate (Phụ lục 1) - Xác định hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết bằng phương pháp Mayalen Zubia [18] (Phụ lục 1)
- Xác định hàm lượng alginate bằng phương pháp khối lượng (Phụ lục 1) - Xác định fucoidan bằng phương pháp A.I.Usov (Phụ lục 1)
2.3.2. Phương pháp cảm quan
Tiến hành đánh giá cảm quan dịch chiết theo phương pháp mô tả.
2.3.3. Phương pháp thử hoạt tính
- Hoạt tính oxy hóa tổng số theo phương pháp Prieto et al. (1999)[24] (Phụ lục 1) - Hoạt tính khử sắt theo phương pháp Zhu, Chang, and Hsu (2000)[34] (Phụ lục 1) - Khả năng bắt gốc DPPH theo phương pháp Yên GC và Chen HY (1995) (Phụ lục 1) - Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp đĩa giấy trên thạch
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
- Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh hóa, mỗi thí nghiệm làm 03 lần. Kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
- Sử dụng phần mềm Microsoft office Excel để xử lý số liệu.
2.4. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
- Hóa chất: Các loại hóa chất sử dụng cho toàn bộ quá trình thực hiện các thí nghiệm hóa chất tinh khiết, đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích do Trung Quốc sản xuất.
- Dụng cụ thí nghiệm: Sửdụng thiết bị hiện có của phòng thí nghiệm Hóa phân tích tại Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang như: cốc thủy tinh, bình tam giác, đũa thủy tinh, bình tia, bình định mức, giấy lọc, bình cầu, cân điện tử, tủ sấy, bếp điện, máy so màu, thiết bị ly tâm, máy cô quay, tủ lạnh, tủ đông,...(Phụ lục 4).
Chương III - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN