3.6.1. Kết quả xác định tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Các mẫu chiết (chất khô) với hàm lượng khác nhau có biểu hiện khả năng bẫy các gốc tự do SC% sẽ được thử nghiệm tiếp để tìm giá trị SC50 (SC50 là % hoạt động
của chất chống oxy hóa theo nồng độ (µg/ml) trung hòa 50% gốc tự do DPPH) (Philip Molyneux, 2004).
Kết quả xác định ảnh hưởng của nồng độ chất khô tới hoạt tính chống oxi hóa và khả năng bắt gốc SC50 được thể hiện trong bảng 3.14 (Phụ lục 2), hình 3.14.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1 2 3 4 5 chất khô (mg) % S C Chất khô (mg) % SC
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô lên khả năng bắt gốc DPPH
Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm thu được có hoạt tính chống oxy hóa cao. Khả năng bắt gốc SC50 = 2,02 mg/ml. Khả năng bẫy gốc tự do của chất khô (%SC) cao nhất là 40,16% tại hàm lượng chất khô 3,5 mg. Khả năng bẫy gốc tự do giảm dần khi hàm lượng chất khô giảm dần, thấp nhất là 6,91% với hàm lượng chất khô là 0,75 mg. Nhìn trên hình 3.14 có thể thấy ngay hàm lượng chất khô và khả năng chống oxy hóa tỉ lệ thuận. Nồng độ chất khô càng cao thì khả năng chống oxy hóa càng tăng lên.
3.6.2. Hoạt tính kháng khuẩn
Vi sinh vật kiểm định được nuôi trên môi trường Mueller Hinton Broth ở 37oC trong 18 giờ trước khi thử nghiệm hoạt tính. 100 µl dịch nuôi cấy có chứa 107 – 108 CFU/g được trải lên môi trường đĩa thạch Tryptic Soy agar (Merck) đã được đục lỗ. Dịch chiết (200µl) mẫu được nhỏ vào các lỗ trên đĩa thạch, ủ trong tủ ấm với điều kiện tương tự như trên. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch và được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch. Đơn vị hoạt tính được tính bằng mm vòng kháng khuẩn.
Vi sinh vật kiểm định sử dụng trong nghiên cứu này gồm: nhóm vi khuẩn Gram (–) (Raoultella terigena, Enterobacter cloace, Pseudomonas alruginosa, Vibrio parahaemolyticus)
và nhóm vi khuẩn Gram (+) (Staphylococcus hominis, Baccillus subtilis)
Bảng 3.15. Đường kính vòng kháng khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Gram (+) Gram (-) Mẫu rong Staphylococcus hominis Baccillus subtilis Enterobacter cloace Pseudomonas alruginosa Vibrio parahaemolyticus Raoultella terigena Padina boryana - 9 - 12 - -
Kết quả cho thấy, sản phẩm phlorotannin thô chiết từ rong Padina có khả năng kháng cả khuẩn Gram (–) và Gram (+), đặc biệt là nhóm vi khuẩn Baccillus subtilis
thuộc nhóm trực khuẩn, sống hiếu khí, ký sinh có bào tử có thể sống sót trong độ nóng
cùng cực khi nấu ăn, gây hư hỏng thức ăn và nhóm vi khuẩn Pseudomonas alruginosa
là nhóm trực khuẩn mủ xanh phổ biến gây bệnh ở người và động vật.
Pseudomonas alruginosa không chỉ phát triển trong môi trường không khí bình thường mà còn có thể sống trong môi trường ít oxy. Ở động vật, nhờ khả năng thích ứng, nó có khả năng lây nhiễm, phá hủy mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch, gây viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu, thận,... sẽ gây ra những hậu quả chết người.
(Balcht, Aldona and Smith, Raymond (1994), Pseudomonas alruginosa infections and
treatment informa health care, 83 – 84.). Mặt khác, vi khuẩn này lại có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh.
Do đó có thể nói rằng sản phẩm phlorotannin thô chiết từ rong Padina có khả năng kháng bệnh, có tiềm năng sử dụng làm thực phẩm chức năng và dược liệu.
3.6.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
3.6.3.1. Phương pháp phân tích
- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy - Xác định độ ẩm theo TCVN 1867:2001
- Xác định hàm lượng khoáng theo TCVN 4329-86
- Xác định hàm lượng xơ thô theo Crudefibre và định lượng carbohydrate
- Xác định hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết bằng phương pháp Mayalen Zubia [18] - Xác định kim loại nặng theo TCVN 5779:1990 (As), TCVN 5780:1990 (Pb). TCVN 5152:1990 (Hg), AOAC 945.58 (Cd)
- Xác định các chỉ tiêu vi sinh
Phương pháp lấy mẫu: TCVN 6400:1998.
Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí : TCVN 5165 :90 Xác định Escherichia coli : TCVN 6505-1 :1999. Xác định Staphylococcus aureus: TCVN 4830:89. Xác định Salmonella: TCVN 6402:1998. Xác định nấm men, nấm mốc: TCVN 6265:1997. Enterobacteria 5518-2-2997
3.6.3.2. Tiêu chuẩn cơ sở
Bảng 3.16. Tiêu chuẩn cơ sở bột chiết rong biển chứa phlorotannin STT Yêu cầu kỹ thuật Đơn vị tính Tiêu chuẩn áp dụng
1 Chỉ tiêu cảm quan
Trạng thái Dạng bột khô
Màu sắc Từ màu nâu vàng đến nâu đen
Mùi vị Mùi đặc trưng của rong biển
không có vị lạ 2 Chỉ tiêu lý hóa Độ ẩm < 9,0 Hàm lượng phlorotannin % KL 20-25 Hàm lượng chất khoáng % KL 15-20 Hàm lượng carbohydrate % KL 20-25
3 Hàm lượng kim loại nặng DĐVN -III
Pb mg/kg ≤ 10,0
As mg/kg ≤ 2,0
Cd mg/kg ≤ 0,3
Hg mg/kg ≤ 0,5
4 Các chỉ tiêu vi sinh DĐVN -III
Tổng số vi sinh vật hiếu khí (Kl/g) Kl/g ≤ 104
Escherichia coli (Kl/g) Kl/g Không có
Pseudomonas alruginosa (Kl/g) Kl/g Không có
Salmonella (Kl/25g) Kl/25g Không có
Enterobacteria Kl/g ≤ 5.102
Nấm và mốc Kl/g ≤ 102
3.6.3.3. Kết quả phân tích sản phẩm (Phụ lục 3)
Bảng 3.17. Kết quả phân tích sản phẩm bột chiết rong biển chứa phlorotannin STT Yêu cầu kỹ thuật Đơn vị tính Kết quả phân tích
1 Chỉ tiêu cảm quan
Trạng thái Dạng bột khô
Màu sắc Từ màu nâu vàng đến nâu đen
Mùi vị Mùi đặc trưng của rong biển
không có vị lạ 2 Chỉ tiêu lý hóa Độ ẩm 7,0 Hàm lượng phlorotannin % KL 20 Hàm lượng chất khoáng % KL 17 Hàm lượng carbohydrate % KL 20
3 Hàm lượng kim loại nặng DĐVN -III
Pb mg/kg 8,0
As mg/kg 1,2
Cd mg/kg 0,2
Hg mg/kg 0,2
4 Các chỉ tiêu vi sinh DĐVN -III
Tổng số vi sinh vật hiếu khí (Kl/g) Kl/g ≤ 104
Escherichia coli (Kl/g) Kl/g Không có
Pseudomonas aeruginosa (Kl/g) Kl/g Không có
Staphylococcus aureus (Kl/g) Kl/g Không có
Salmonella (Kl/25g) Kl/25g Không có
Enterobacteria Kl/g ≤ 5.102
3.6.3.4. Định hướng sử dụng làm thực phẩm chức năng
Khái niệm thực phẩm chức năng (Functional foods) được người Nhật sử dụng đầu tiên trong những năm 1980, để chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao sức khoẻ cho người sử dụng. Ở Việt Nam, Bộ Y tế định nghĩa thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh.
Hiện nay các nước phát triển có xu hướng ưa chuộng dùng các thực phẩm chức năng hơn dùng thuốc. Sản phẩm phlorotannin thô có khả năng chống oxi hoá và kháng khuẩn cao, do đó có thể định hướng sử dụng làm thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, hỗ trợ điều trị trong y học. Một số hướng ứng dụng đối với sản phẩm phlorotannin thô:
- Có thể sản xuất các dạng viên nang, viên nén, viên sủi, kết hợp với việc bổ sung vitamin và khoáng chất (trong một viên) hỗ trợ điều trị một số bệnh về sự thiếu hụt vitamin và khoáng chất, giải quyết tình trạng “nạn đói tiềm ẩn” vì thiếu vi chất dinh dưỡng và lão hoá sớm, tăng cường hệ miễn dịch chống lại các tình trạng viêm nhiễm ngoài da cũng như viêm nhiễm nội tế bào.
- Có thể sản xuất trà hoà tan, hỗ trợ điều trị tình trạng viêm nhiễm ở các cơ quan, các bệnh lý như tim mạch, bệnh thần kinh, đục thuỷ tinh thể, thoái hóa hoàng điểm ở mắt, nguy cơ các bệnh ung thư và nhất là tình trạng sớm xuất hiện hiện tượng lão hoá.…
Nói chung, biết được lợi ích của chất chống ôxy hóa và kháng khuẩn trong việc phòng chống bệnh tật, lão hoá, ta có thể ngăn ngừa sự tăng sinh các gốc tự do có trong cơ thể một cách toàn diện bằng cách bổ sung các chất chống oxi hoá cho cơ thể đồng thời góp phần chống ô nhiễm môi trường, dinh dưỡng đúng cách, tránh ăn uống quá thừa năng lượng, vận động hợp lý, tránh nghiện rượu, thuốc lá, phòng các bệnh viêm nhiễm, có cuộc sống lành mạnh giúp thư thái, lạc quan, yêu đời, nên ăn nhiều rau cải, trái cây tươi... Đây là nguồn cung cấp các chất chống ôxy hóa ngoại sinh tốt nhất.
3.7. Đề xuất quy trình tách chiết phlorotannin thô từ một số loài rong Padina
vùng biển Nam Trung Bộ, sử dụng làm thực phẩm chức năng có hoạt tính chống oxi hóa và kháng khuẩn
* Sơ đồ quy trình
Hình 3.15. Sơ đồ quy trình chiết rút phlorotannin thô từ rong Padina vùng biển Nam Trung Bộ, sử dụng làm thực phẩm chức năng có hoạt tính chống oxi hóa và
kháng khuẩn
Sản phẩm thực phẩm chức năng Sấy phun
Rong nguyên liệu (khô)
Rửa sạch
Cắt nhỏ (Băm nhuyễn)
Chiết rút Lọc
- Dung môi ethanol 70% - Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: 1:35 - Nhiệt độ ủ: 400C - Thời gian ủ: 30h Dịch lọc Ly tâm (15’) Cô đặc (500C, 6h) Thẩm tách Bã rong Sản xuất alginate Thu hồi dung môi
Giải thích quy trình: - Nguyên liệu:
Rong khô thu mua đã được xử lý và có nguồn gốc rõ ràng.
- Rửa sạch:
Rong được rửa sạch nhằm loại bỏ tạp chất và muối bám dính trên rong, tạo điều kiện cho quá trình chiết và lọc được dễ dàng.
- Cắt nhỏ:
Cắt hoặc băm nhỏ với kích thước thuận lợi cho quá trình chiết rút, mục đích là làm tăng diện tích tiếp xúc của rong nguyên liệu và dung môi, đồng thời phá vỡ cấu trúc tế bào rong, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi. Tuy nhiên, không xay hoặc nghiền rong quá nhỏ, bởi kích thước bột rong quá nhỏ sẽ làm cản trở quá trình lọc.
- Chiết rút:
Phlorotannin là hợp chất hữu cơ có khả năng tan trong một số dung môi phân cực. Các yếu tố dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết đều có ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của phlorotannin trong quá trình chiết.
Khi tiến hành thí nghiệm, cố định các thông số: + Dung môi ethanol 70%
+ Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: 1:35 + Nhiệt độ ủ: 400C
+ Thời gian ủ: 30h
- Lọc:
Sau khi chiết rút, tiến hành lọc thu hồi các chất hào tan được trong dung môi, loại bỏ tạp chất không tan (cặn, bã rong).
- Thẩm tách:
Thẩm tách nhằm loại bỏ lượng muối còn sót lại trong dịch rong, tạo điều kiện cho quá trình cô đặc và làm khô về sau.
- Cô đặc:
Cô đặc nhằm mục đích loại bỏ bớt dung môi trong dịch lọc nhờ quá trình bay hơi dung môi bởi nhiệt độ và áp suất, tạo điều kiện thuận lợi cho công đoạn sấy phun. Chọn nhiệt độ cô đặc 500C, thời gian cô khoảng 6 giờ trên 1lít dung môi.
- Ly tâm:
Ly tâm rong nhằm loại bỏ hết các tạp chất hoặc bã rong còn sót lại sau khi lọc và cô đặc. Tiến hành ly tâm trong vòng 15 phút, với tốc độ 5000 vòng/phút.
- Sấy phun:
Mục đích của quá trình sấy tách triệt để toàn bộ dung môi còn lại trong dịch rong, lượng chất tan trong dịch tồn tại dưới dạng khô bột, tăng độ bền và bảo quản sản phẩm được lâu hơn. Điều kiện sấy phun như sau: tỉ lệ pha loãng tủa : cồn là 1:4; lưu lượng phun của dung dịch sấy là 2 - 3,5 lít/giờ; nhiệt độ buồng sấy là 600C và đầu ra là 400C.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, cho phép rút ra kết luận như sau:
1.1. Thông số thích hợp cho quá trình chiết phlorotannin thô từ rong Padina vùng biển Nam Trung Bộ:
- Dung môi chiết: cồn ethanol 70% (Tỉ lệ ethanol : nước = 7:3) - Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: 1: 35
- Nhiệt độ chiết: 400C - Thời gian chiết: 30h. - Số lần chiết: 3 lần
- Điều kiện quá trình cô đặc: cô dịch rong ở nhiệt độ 500C trong thời gian 6h trên 1 lít dung môi.
- Điều kiện quá trình ly tâm: thời gian ly tâm là 15 phút, với tốc độ 5000 vòng/ phút. - Điều kiện quá trình sấy phun: tỉ lệ pha loãng tủa : cồn là 1:4, lưu lượng chảy của dung dịch sấy là 2 - 3,5 lít/giờ, nhiệt độ buồng sấy là 600C và đầu ra là 400C.
1.2. Kết quả phân tích sản phẩm bột chiết rong biển chứa phlorotannin đạt tiêu chuẩn cơ sở bột chiết rong biển chứa phlorotannin, có hoạt tính chống oxi hoá và kháng khuẩn cao, có thể sử dụng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị một số bệnh về viêm nhiễm, tim mạch, ung thư,....
2. Kiến nghị
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, cho phép đề xuất kiến nghị như sau:
- Cần nghiên cứu thêm các phương pháp thu hái, bảo quản rong nguyên liệu, hạn chế tổn thất các thành phần quý của rong, đồng thời đảm bảo nguồn nguyên liệu ngay cả trong thời gian trái vụ.
- Có thể nghiên cứu thêm quy trình, đặc biệt trong công đoạn chiết (như nghiên cứu chiết phlorotannin ở vùng biển có điều kiện sống khác nhau của cùng một loài rong, thực hiện chiết rong trong các điều kiện khác nhau: pH khác nhau, dung môi khác,...) (Các vấn đề này còn ít được nghiên cứu trong nước).
- Cần nghiên cứu khả năng ứng dụng rộng rãi của chế phẩm vào trong các lĩnh vực như: thực phẩm, dược phẩm, y học, mỹ phẩm,...Đặc biệt, kết hợp với ngành y tế, nghiên cứu sâu về vai trò của phlorotannin với sức khỏe con người như khả năng chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn,...từ đó có hướng sản xuất các sản phẩm cụ thể cung cấp cho thị trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đặng Xuân Cường (2009), Nghiên cứu thu nhận dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn
từ rong nâu Dictyota Dichotoma Việt Nam, luận văn thạc sỹ, Đại học Nha Trang.
2. Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn Tiến (1993),
Rong biển Việt Nam (phần phía Bắc), NXB KH & KT, HCM, 364 tr.
3. Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc
gia thành phố Hồ Chí Minh.
4. Phạm Hoàng Hộ (1969), Rong biển Việt Nam, Trung tâm học liệu xuất bản.
5. Bùi Minh Lý, Trần Thị Luyến, Trần Thị Thanh Vân, Đặng Xuân Cường (2009), “Ảnh hưởng của các điều kiện chiết khác nhau tới hiệu suất chiết hỗn hợp phenol
tổng trong rong nâu Dictyota dichotoma”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy
sản, ISSN:1859-2252, 147-151.
6. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004),
Chế biến rong biển, NXB Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh.
7. Vũ Hồng Sơn; Hà Duyên Tư (2009), “Nghiên cứu trích li polyphenol từ chè xanh
vụn”, TC Khoa học và Công nghệ, (2), 39-46.
8. Mai Tuyên, Vũ Bích Lan (1999), “Nghiên cứu tách chiết và xác định tác dụng chống oxi hóa của polyphenol từ lá chè xanh Việt Nam”, Tạp chí Công nghiệp Hoá chất, (9).
9. Trần Thị Thanh Vân, Đặng Xuân Cường, Cao Thị Thúy Hằng, Võ Mai Như Hiếu
và Bùi Minh Lý (2009), Thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của dung
dịch chiết ethanol giàu iốt tự nhiên từ rong nâu, Hội thảo về nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ vật liệu KC02/06-10, Hà Nội.
Tiếng Anh
10. A. K. Swanson & L. D. Druehl. (2002), “Induction, exudation and the protective role of kelp phlorotannins”, Aquatic botany, 73, 241-253.
11. Alejandro Cabello-Pasini, Víctor Macías-Carranza, Roberto Abdala, Nathalie Korbee, Félix L. Figueroa (2011), “Effect of nitrate concentration and UVR on photosynthesis, respiration, nitrate reductase activity, and phenolic compounds in Ulva rigida (Chlorophyta)”, Journal of Applied Phycology,23(3), 363-369.
12. Changjong Moon, Sung-Ho Kim, Jong-Choon Kim, Jin Won Hyun, Nam Ho Lee, Jae Woo Park and Taekyun Shin (2008), “Protective effect of phlorotannin components phloroglucinol and eckol on radiation-induced intestinal injury in mice”, Phytotherapy Research, 22(2), 238–242.
13. Jormalainen, V., Honkanen, T., Koivikko, R. and Era ¨nen, (2003), “Induction of phlorotannin production in a brown alga: defense or resource dynamics?” – Oikos,
103, 640–650.
14. Hye Sook Kang, Hae Young Chung, Jee Hyung Jung, Byeng Wha Son and Jae Sue