3. Định hướng ứng dụng của vật liệu nanocomposite (Fe3O4-CdSe/CdS) với lớp phủ
3.2. Ứng dụng bên trong cơ thể “in vivo”
3.2.1. Dẫn truyền thuốc
Một trong những nhược điểm quan trọng nhất của hóa trị liệu, đó là tính không đặc hiệu. Khi vào trong cơ thể, thuốc chữa bệnh như doxorubicin, epirubicin… thực chất là các loại “độc dược” sẽ phân bố khắp cơ thể và không tập trung vào cơ quan/bộ phận xuất hiện khối u, dẫn các tế bào mạnh khỏe cũng bị ảnh hưởng do tác dụng phụ của thuốc, làm cho bệnh nhân suy giảm sức khỏe và sức đề kháng đồng thời xuất hiện các triệu chứng thường gặp như vàng da, rụng tóc, đắng miệng... Hiện nay, hóa học trị liệu
đang là một phương pháp rất phổ dụng để điều trị bệnh ung thư. Tuy nhiên đây cũng là phương pháp chữa bệnh phân tán và gây rất nhiều tác dụng phụ, do đó trong các bước điều trị ung thư người ta thêm vào công đoạn miễn dịch trị liệu sau khi thực hiện hóa trị liệu để giúp bệnh nhân hồi phục sức khỏe để tiếp tục bước xạ trị hoặc hóa trị [36]. Để thực hiện phương pháp này, trước hết người ta phải tính đến liều lượng mức chịu đựng cho từng bệnh nhân. Điều này có nghĩa là các bệnh nhân có sức khỏe yếu không thể nhận đủ liều lượng để chữa trị dứt điểm các tế bào ung thư trong cơ thể. Trong trường hợp đó, nếu hướng đích được việc vận chuyển thuốc và có biện pháp giữ cho thuốc không bị nhả ra trước khi đến đích không những sẽ làm giảm ảnh hưởng đến các tế bào mạnh mà còn tăng được đủ liều lượng để chữa trị thành công. Chính vì thế việc dùng các hạt từ tính như là hạt mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơ thể (thông thường dùng điều trị các khối u ung thư) đã được nghiên cứu từ những năm 1970, những ứng dụng này được gọi là dẫn truyền thuốc bằng hạt từ tính. Có hai lợi ích cơ bản là:
(i) Thu hẹp phạm vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc.
(ii) Giảm lượng thuốc điều trị.
Hình 1.42. Cơ chế dẫn truyền thuốc nhắm đích nhằm điều trị ung thư trong cơ thể người trên nền tảng vật liệu nanocompostie nhạy cảm nhiệt độ
Gardient từ trường ngoài rất mạnh
Nanocomposite mang thuốc
40-42o
Khối u ung thư
Nâng thân nhiệt
Doxorubicin
Hạt nano Hạt nano tải thuốc
Tế bào đích Thuốc
Vật liệu nanocompostie có tính tương hợp sinh học được gắn kết với thuốc điều trị. Lúc này hạt nano có tác dụng như một hạt mang thuốc. Thông thường hệ thuốc/hạt tạo ra một chất lỏng từ và đi vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn. Khi tiêm các hạt thuốc có kích thước phù hợp với ngưỡng thâm nhập của cơ thể đi vào mạch máu (tĩnh mạch), sau khi đi vào hệ tuần hoàn mà không bị bắt giữ, người ta dùng một gradient từ trường ngoài rất mạnh để tập trung các hạt vào một vị trí nào đó trên cơ thể. Một khi hệ thuốc/hạt được tập trung tại vị trí cần thiết và trải qua các quá trình thực bào và thẩm bào của các đại thực bào thì quá trình nhả thuốc có thể diễn ra thông qua cơ chế hoạt động của các enzym hoặc các tính chất sinh lý học do các tế bào ung thư gây ra như độ pH, quá trình khuyếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt độ (gây sốt nhẹ cục bộ) (Hình 1.42). Quá trình vật lý diễn ra trong việc dẫn truyền thuốc cũng tương tự như trong phân tách tế bào. Gradient từ trường có tác dụng tập trung hệ thuốc/hạt.
Hiệu quả của việc dẫn truyền thuốc phụ thuộc vào cường độ từ trường, gradient từ trường, thể tích và tính chất từ của hạt nano mang thuốc. Thêm vào đó, các chất mang (chất lỏng từ) thường được tiêm vào các tĩnh mạnh hoặc động mạch nên các thông số thủy lực - dược động học như thông lượng máu, nồng độ chất lỏng từ, thời gian tuần hoàn đóng vai trò quan trọng như các thông số sinh lý học như khoảng cách từ vị trí của thuốc đến nguồn từ trường, mức độ liên kết thuốc/hạt, và thể tích của khối u. Các hạt có kích thước micro mét (tạo thành từ những hạt siêu thuận từ có kích thước nhỏ hơn) hoạt động hiệu quả hơn trong hệ thống tuần hoàn đặc biệt là ở các mạch máu lớn và các động mạch.
Nguồn từ trường thường là nam châm NdFeB có thể tạo ra một từ trường khoảng 0,2 T và gradient từ trường khoảng 8 T/m với động mạch đùi và khoảng 100 T/m với động mạch cổ. Điều này cho thấy quá trình dẫn thuốc bằng hạt nano từ tính có hiệu quả ở những vùng máu chảy chậm và gần nguồn từ trường. Tuy nhiên, khi các hạt nano chuyển động ở gần thành mạch máu thì chuyển động của chúng không tuân theo định luật Stoke nên với một gradient từ trường nhỏ hơn quá trình dẫn thuốc vẫn có tác dụng. Các hạt nano từ tính thường dùng là oxít sắt (magnetite Fe3O4, maghemite ∝-Fe2O3) bao phủ xung quanh bởi một hợp chất cao phân tử có tính tương hợp sinh học như PVA,
detran hoặc silica SiO2... Chất bao phủ có tác dụng chức năng hóa bề mặt để có thể liên kết với các phân tử khác như nhóm chức carboxyl, biotin, amino…
Nghiên cứu dẫn truyền thuốc đã được thử nghiệm rất thành công trên động vật, đặc biệt nhất là đã được ứng dụng để điều trị u não. Việc dẫn truyền thuốc đến các u não rất khó khăn vì thuốc cần phải vượt qua “hàng rào” ngăn cách giữa não và máu, nhờ có sự trợ giúp của hạt nano từ có kích thước 10-20 nm, việc dẫn truyền thuốc có hiệu quả hơn rất nhiều. Việc áp dụng phương pháp này đối với người tuy đã có một số thành công, nhưng còn rất khiêm tốn và cần một thời gian dài nghiên cứu trên động vật, phân tích và lưu lại các chỉ số phân bào, các đột biến có thể xảy ra, các tác dụng phụ không mong muốn, mô hình tính toán lượng thuốc tiêm phù hợp với kích thước khối u, loại ung thư, độ tuổi của bệnh nhân và cơ chế hỗ trợ giúp thải trừ thuốc còn dư ra khỏi cơ thể mà không gây ra các tác dụng phụ không mong muốn. Thêm vào đó việc xây dựng một phương pháp dự phòng trong trường hợp như sốc phản vệ làm bệnh nhân sau khi tiêm thuốc bị sốt đột ngột, gây ảnh hưởng đến cơ chế nhả thuốc làm thuốc không đến được đích là một điều cần phải được quan tâm.[38]
3.2.2. Đánh dấu, tạo ảnh sinh học cho tế bào
Trong công nghệ sinh học, hệ vật liệu nanocomposite có chứa thành phần là các chấm lượng tử phát quang được ứng dụng làm các chất đánh dấu sinh học và hiện ảnh các tế bào (cellular imaging) (Hình 1.43).
Hình 1.43. Tạo ảnh sinh học bằng phương pháp phát huỳnh quang trên cơ thể chuột
Khi các hạt nanô bán dẫn được đính vào phân tử dược phẩm, đường đi của dược phẩm có thể được theo dõi nhờ quan sát màu sắc ánh sáng phát ra khi chiếu nguồn
sáng kích thích vào những vùng cần theo dõi .[39]
Trái lại các chấm lượng tử bán dẫn có thể cho những màu sắc rất khác nhau tuỳ thuộc vào kích thước hạt nanô. Với nền tảng là cơ chế tự hợp của kháng nguyên – kháng thể, người ta đính các hạt nanô bán dẫn vào kháng thể để phát hiện kháng thể bám vào protêin nào của tế bào ung thư (Hình 1.44). Hơn nữa có thể dùng tổ hợp các hạt nanô cho màu sắc khác nhau đ ể đ ánh dấu theo kiểu mã vạch. Ví dụ dùng ba loại hạt nanô cho ba màu xanh, vàng, đỏ, ta có thể tổ hợp tuyến tính để có các mã vạch: xanh, vàng, đỏ; xanh, xanh, vàng; vàng, đỏ, đỏ; xanh, vàng, vàng,... vô cùng phong phú. Các chấm lượng tử phổ biến nhất được dựa trên vật liệu AIIBVI (CdS, CdSe, ZnS, …) vì các vật liệu này có độ rộng vùng cấm thẳng, dải phát xạ của phổ hấp thụ nằm trong vùng nhìn thấy và một phần nằm trong vùng tử ngoại gần, chúng rất thích hợp với một số lớn các nguồn laser dùng trong thực nghiệm.
Hình 1.44. Ảnh sinh học của tế bào ung thư quan sát dưới kính hiển vi quang học có nguồn kích thích UV [35
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM
1. Chuẩn bị trước thực nghiệm 1.1. Mục đích thí nghiệm
Quá trình thực nghiệm nhằm tạo ra hệ vật liệu nanocomposite đa chức năng chứa các thành phần siêu thuận từ Fe3O4 và chấm lượng tử cấu trúc lõi/vỏ CdSe/CdS được bao bọc trong lớp phủ polymer Poly(Glycidyl methacrylate) nhạy cảm với nhiệt độ có dạng hình cầu, tính đồng đều về kích thước, siêu thuận từ, hiệu suất huỳnh quang cao và phân tán tốt trong dung môi để đạt được các tiêu chí nhằm ứng dụng vào lĩnh vực y- sinh học trong các hướng phát triển tiếp theo của đề tài.
1.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
Becher loại 50 ml và 250 ml, ống đong, đũa khuấy, phễu chiết 250 ml, lọ đựng mẫu, pipet, micropipet, bình ba cổ, nhiệt kế, bóp cao su... (hình 2.1) và các thiết bị: cân phân tích, máy khuấy từ, máy khuấy cơ, máy rung siêu âm, tủ hút, tủ sấy chân không, bình khí nitơ, nam châm vĩnh cửu, máy quay ly tâm... (hình 2.2)
Hình 2.2. Một số thiết bị dùng trong thí nghiệm: (a) Cân phân tích, (b) máy khuấy từ, (c) máy quay li tâm , (d) máy rung siêu âm
1.3. Quy trình thí nghiệm
Có 2 cách để chế tạo vật liệu nanocomposite, một là chế tạo vật liệu nền trước sau đó thêm vào các vật liệu thành phần, hai là chế tạo trước các vật liệu thành phần sau đó tổng hợp vật liệu nền.
Hình 2.3. Sơ đồ khối quy trình chế tạo hệ vật liệu nanocomposite (SPION-QD) Fe3O4- CdSe/CdS với lớp vỏ bọc polymer PGMA
a) b) c) d) F-M-PGMA Trùng hợp Ethylene Diamine F e 3 + F e 2 + + N H 3 .H 2O CdSe/CdS QDs Amino-PGMA PGMA GMA M-PGMA
Tùy vào điều kiện cũng như tính chất của các bước thí nghiệm, hóa chất thí nghiệm mà ta có thể linh hoạt chọn các bước thực nghiệm cần thiết, từ đó đưa ra sơ đồ khối để tiến hành thí nghiệm (Hình 2.3)
1.4. Hóa chất tiến hành thí nghiệm
Bảng 2.1. Danh sách các hóa chất cần thiết trong thực nghiệm
STT TÊN HÓA CHẤT CÔNG THỨC HÓA HỌC
1 2,3 Epoxypropyl (Glycidyl methacrylate) (GMA) C7H10O3 2 Azobis-isobutyronitrile (AIBN) C8H12N4 3 Poly-vinylpyrrolidone (PVP) (C6H9NO)n 4 Ethylene diamine C2H4(NH2)2 5 Ethanol C2H5OH
6 Ferric chloride hexahydrate FeCl3.6H2O
7 Ferrous chloride tetrahydrate FeCl2.4H2O
8 Cadmium acetate dihydrate Cd(CH3COO)2 .2H2O
9 Dimethyl formamide (DMF) C3H7NO
10 Mercaptoethanol (thioglycol) HOCH2CH2SH
11 Sodium selenite pentahydrate Na2SeO3
12 Isopropanol alcohol C3H8O
13 Sodium sulfide Na2S
14 Axit sunfuric H2SO4
15 Amonium hydroxide (25%) NH4OH
16 Natri hidroxit NaOH
17 n-butanol C4H9OH
18 chloroform CHCl3
19 Nước khử iôn (D.I) H2O (D.I)
2. Tiến hành thí nghiệm
2.1. Trùng hợp vật liệu nền Poly(Glycidyl methacrylate) (PGMA) [47-54]
Hình 2.4. Sơ đồ tổng hợp Poly(Glycidyl methacrylate) (PGMA)
Cho 3 g Poly-vinylpyrrolidone (PVP), 152,7 ml Ethanol và 13,5 ml H2O vào bình 3 cổ và khuấy đều, tiếp tục cho 11,2ml monomer Glycidyl methacrylate (GMA) vào 0,24 g 2.2 Azobis-isobutyronitrile sau đó cho vào bình 3 cổ. Duy trì sục khí N2 trong suốt quá trình khuấy, giữ nhiệt độ ~1200C và khuấy liên tục trong 48 giờ. Bắt đầu khuấy hỗn hợp trên, quan sát thấy dung dịch không màu, sau 1 giờ dung dịch chuyển sang màu trắng đục. Tiếp tục khuấy trong 19 giờ, sau phản ứng ta thu được dung dịch có màu trắng đục. Lọc rửa, xử lý mẫu nhiều lần bằng nước khử iôn, quay li tâm và sấy khô sản phẩm. Ta thu được mẫu bột Poly (Glycidyl Methacrylate) (PGMA) (Vật liệu nền).
2.2. Tổng hợp Amino-PGMA
Cho 5 g PGMA tổng hợp được vào 50 ml nước khử iôn, và 50 ml Ethylene diamine được đun nóng ở 1200C và khuấy trong 12 giờ liên tục. Sau phản ứng thu được dung dịch có màu trắng đục. Sau đó rửa nhiều lần với nước khử iôn, quay li tâm và sấy khô sản phẩm. Ta thu được mẫu Amino-PGMA dạng bột.
Bình cầu 3 cổ PGMA PVP Ethanol H2O GMA C7H10O3 AIBN C8H12N4 K h u ấ y 1 6 h ,s ụ c k h í N2 L ọ c rử a, s ấy k h ô
PGMA H2O Ethylene diamine Amino-PGMA 1200C 12 giờ Lọc rửa, sấy khô Hình 2.5. Sơ đồ tổng hợp Amino-PGMA
2.3. Chế tạo chấm lượng tử CdSe lõi
Hình 2.6. Sơ đồ tổng hợp chấm lượng tử lõi CdSe [7,12]
Đầu tiên, cho 2 ml nước vào 0,173 g Na2SeO3, dùng đũa thủy tinh khuấy đều. Sau đó nhỏ từ từ 1,014 ml HOCH2CH2SH vào dung dịch trên (theo tỉ lệ mol M= Mercaptoethanol / Sodium selenite pentahydrate với M=13 [6 ,13]), ta thu được hỗn hợp 1 có màu xá xị.
Nướcgv H2O Na2SeO3 HOCH2CH2SH Cd(CH3COO)2 .2H2O C3H7NO
Hỗn hợp1 Dung dịch CdSe Hỗn hợp 3 M=13 R=4 Khuấy 30 phút Khuấy 30phút Nhỏ giọt Khuấy 30 phút Nung 800C Khuấy 3h Hỗn hợp2
Tiếp tục cho 10 ml C3H7NO vào 1,064 g Cd(CH3COO)2.2H2O và khuấy đều (theo tỉ lệ mol R=Cadmium acetate dihydrate/Sodium selenite pentahydrate với R=4 [8]) ta thu được hỗn hợp 2 không màu.
Tiếp theo, nhỏ hỗn hợp 2 vào hỗn hợp 1, khuấy đều trong 30 phút ta thu được dung dịch có màu vàng nhạt. Sau khi xử lý nhiệt ở 800C và khuấy trong 3 giờ liên tục ta thu được dung dịch chứa các chấm lượng tử CdSe có màu vàng. Bọc kín lọ đựng mẫu lại bằng giấy bạc và bảo quản trong bóng tối trong bình lưu mẫu độc hại được hút chân không, dưới nhiệt độ phòng.
2.4. Chế tạo chấm lượng tử cấu trúc lõi/vỏ CdSe/CdS [5, 55-58]
Thực tế là việc tạo lớp vỏ CdS trên nền chấm lượng tử CdSe lõi thông qua quá trình epitaxy dần dần vật liệu vỏ trên bề mặt của tinh thể chấm lượng tử lõi.
Sử dụng 2 bình cầu 3 cổ, bình F1 đựng 200 ml dung dịch Na2S 0,5M, xilanh tiêm dung tích 6ml chứa dung dịch H2SO4 tiêm xiên qua nút cao su F1. Hai miệng bình được bịt kín bằng nút chặn cao su, miệng bình còn lại được nối với nguồn cấp khí nitơ thổi từ từ vào F1, miệng còn lại nối với một ống thông qua miệng ống của bình F2 (Hình 2.7)
Hình 2.7. Thực nghiệm chế tạo chấm lượng tử lõi/vỏ CdSe/CdS
Bình F2 chứa 40 ml dung dịch chấm lượng tử CdSe lõi đã chế tạo trước đó và 10 ml rượu isopropanol, các miệng ống được bịt kín bằng nút cao su. Sau đó nhỏ dần dần 100 ml NaOH 0,1M vào F2 đến khi trong bình không còn khí phản ứng (H2S). Trong suốt
Sục khí N2
F1: Na2S
F2: CdSe
quá trình phản ứng, khí Nitơ được sục liên tục nhằm tạo môi trường trơ cho thí nghiệm. Ta thu được dung dịch chứa chấm lượng tử lõi/vỏ CdSe/CdS có màu vàng cam.
2.5. Chế tạo thành phần hạt nano từ Fe3O4 trong lớp vỏ Amino-PGMA (M-PGMA)
Hình 2.8. Sơ đồ tổng hợp vật liệu M-PGMA
Trộn 5 g amino-PGMA với 50 ml nước, sau đó khuấy 20 phút và làm lạnh xuống 100C ta thu được hỗn hợp 1.
Trộn 0,8115 g FeCl3.6H2O với 20 ml nước và 0,2985 g FeCl2.4H2O với 20 ml nước, sau đó hạ nhiệt độ xuống 100C và rung siêu âm 20 phút, thu được hỗn hợp 2.
K h u ấy 3 0 p h ú t Hỗn hợp 3 H2O Amino- PGMA FeCl2.H2O H2O FeCl3.H2O H2O 1 0 0 C K h u ấy 2 0 p h ú t Hỗn hợp 1 NH4OH Hỗn hợp 2 8 0 0 C Hỗn hợp 4 M-PGMA L ọ c r ử a , s ấ y k h ô
Trộn hỗn hợp 1 và hỗn hợp 2 tạo được với nhau, thu được dung dịch có màu cam. Tiếp tục nhỏ từ từ 10 ml dung dịch NH4OH vào hai hỗn hợp trên, khuấy 20 phút ta thu được hỗn hợp 3 có màu nâu đen.
Tiếp tục nâng nhiệt độ hỗn hợp 3 lên 800C, đồng thời khuấy trong 30 phút ta thu được hỗn hợp 4 màu nâu đen. Cuối cùng rửa nhiều lần với nước, quay li tâm và sấy khô sản phẩm. Ta thu được mẫu M-PGMA, thử với nam châm vĩnh cửu, ta thấy mẫu thu được có từ tính.
2.6.Tổng hợp F-M-PGMA chứa thành phần chấm lượng tử CdSe/CdS
Hình 2.9. Sơ đồ tổng hợp vật liệu F-M-PGMA
Đong 9,5 ml butanol và 0,5 ml Chloroform cho vào dung dịch chứa chấm lượng tử lõi/vỏ CdSe/CdS, sau đó cho vào khuấy cùng với M-PGMA. Sau khi khuấy 2 giờ, ta