3. Định hướng ứng dụng của vật liệu nanocomposite (Fe3O4-CdSe/CdS) với lớp phủ
3.1. Ứng dụng ngoài cơ thể “in vitro”
3.1.1 Chẩn đoán và xét nghiệm bệnh
Nguyên lý phát hiện tế bào bệnh và các vi khuẩn dựa trên phương pháp ELISA. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA là là một kỹ thuật sinh hóa dựa vào cơ chế tự hợp đặc hiệu (tự ghép cặp) giữa kháng nguyên - kháng thể và để phát
hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học.
Hình 1.36. Phương pháp ELISA trong xét nghiệm y-sinh học
Nguyên lý của ELISA gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên (Antigen) chưa biết được gắn trên một bề mặt;
(2) Kháng thể (antibody) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme
(3) Thêm vào một cơ chất (Substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Với ELISA phát quang, ánh sáng được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên-kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên-kháng thể sẽ quyết định cường độ cũng như màu sắc ánh sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate), gồm 2 phương pháp: -Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên được gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa.
-Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra.
Sau đó, kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên- kháng thể có thể xảy ra.
Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng nguyên thứ cấp (secondary antigen) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng nguyên thứ cấp này.. Sau khi tạo được phức hợp kháng thể đặc hiệu, tiến hành kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn đích. Có nhiều cách phát hiện vi khuẩn đích như:
-Quan sát và đếm trực tiếp các tế bào vi khuẩn phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang.
-Xác định số lượng vi khuẩn đích bằng đường chuẩn giữa cường độ phát quang của vi khuẩn gắn “thuốc thử” và số lượng vi khuẩn trong dung dịch chuẩn. Cường độ phát huỳnh quang là hàm số f của số lượng tế bào vi khuẩn đích trong mẫu.
Hình 1.37. Quan sát các mẫu bệnh phẩm dưới kính hiển vi huỳnh quang
Trước đây các cơ chất tạo màu sắc (các chất màu hữu cơ) được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Vật liệu nanocomposit (SPION-QD) (Fe3O4-CdSe/CdS) với lớp phủ polymer chế tạo thành công trong luận văn này với thành phần chấm lượng tử cấu trúc lõi/vỏ CdSe/CdS có hiệu suất huỳnh quang khá cao hứa hẹn sẽ làm tăng tính
đặc hiệu, độ chính xác cho việc phát hiện và đánh dấu tế bào bệnh, cũng như các loại vi khuẩn. Thực nghiệm đã chứng minh được càng nhiều cầu nối trung gian giữa kháng thể và hạt nano chứa tâm màu phát quang càng làm cho phức hợp bền vững hơn và kháng thể không mất hoạt tính lâu hơn. Vỏ bọc polymer Poly(Glycidyl methacrylate) có diện tích bề mặt lớn hơn, hoạt hóa biến tính bề mặt để tạo nhóm chức amino NH2- nhằm đính với kháng nguyên/kháng thể dễ dàng hơn, số lượng cầu nối trung gian giữa các kháng thể trên bề mặt với chấm lượng tử cấu trúc lõi vỏ CdSe/CdS nhiều hơn so với vật liệu SiO2 được nghiên cứu trước đây.
Hình 1.38 là ảnh TEM và SEM của vi khuẩn Ecoli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp kháng thể + hạt nano silica SiO2 được thực hiện trong một công trình nghiên cứu trong nước [32], bước đầu đã chế tạo thành công phức hợp kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích được bao bọc bằng hạt nano silica SiO2 bằng cách gắn trực tiếp các phân tử kháng thể lên bề mặt hạt silica thông qua liên kết amine–carboxylic với sự có mặt của chất xúc tác EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) trong các điều kiện sau: EDAC/1 phản ứng là 0,9mg; tỉ lệ kháng thể với hạt silica là 40/1; thời gian phản ứng hợp sinh 3 giờ có lắc ngang, nhiệt độ ủ ở 300C.
Hình 1.38. Ảnh TEM và SEM của vi khuẩn Ecoli O157:H7 được bao bọc bởiphức hợp kháng thể + hạt nano silica SiO2 [11]
Phức hợp kháng thể và hạt silica được tạo thành này có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích E. coli O157:H7 trong vòng 20 phút, tỉ lệ vi khuẩn đích gắn phức hợp và phát quang đạt > 60% và sau 3 ngày vẫn phức hợp vẫn giữ nguyên hoạt tính. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật này đối vối vi khuẩn đích là 102 CFU/ml, thời gian phát hiện nhanh hơn các phương pháp thông thường nhiều lần. Ảnh TEM và SEM
của tế bào E.coli O157:H7 được đánh dấu bởi phức hợp kháng thể + hạt nano silica đã chứng minh rằng phức hợp này có thể bao bọc đều hoàn toàn và như nhau lên bề mặt tế bào vi khuẩn. Qua đó có thể khẳng định các hạt nano silica hợp sinh với kháng thể vẫn giữ nguyên tính chất phát quang hiệu quả và các phân tử kháng thể khi gắn với hạt nano silica vẫn giữ được hoạt tính và có khả năng nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích.
Hình 1.39.Ảnh huỳnh quang: (a) phức hợp hạt nano silica – kháng thể; (b) Vi khuẩn gắn với phức hợp kháng thể - Silica; (c) Vi khuẩn gắn với phức hợp kháng thể - QDs
Hình 1.40. Phổ huỳnh quang của phức hợp hạt silica – kháng thể gắn kết với vi khuẩn E.coli O157:H7 [11]
Hình 1.40 chính là cơ sở để xây dựng đường chuẩn: cường độ phổ - số lượng E.coli O157:H7giúp phát hiện nhanh, nhạy số lượng vi khuẩn ở mật độ thấp. Trong xét nghiệm và chẩn đoán các loại bệnh ung thư, mỗi loại ung thư đều có một đặc điểm nhận dạng sinh học riêng mà thuật ngữ y học gọi là các mắc-kơ ung thư (marker). Các mắc-kơ này có đặc điểm là xuất hiện trong máu và với nồng độ cao khi khối u ung thư xuất hiện nên
nó rất có giá trị trong việc chẩn đoán ung thư. Một số mắc-kơ điển hình như PSA chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt, AFP giúp chẩn đoán ung thư gan, CA giúp chẩn đoán ung thư vú, CEA giúp chẩn đoán ung thư buồng trứng. Do đó, mỗi khi nghi ngờ bị ung thư một cơ quan nào đó với các biểu hiện lâm sàng chung hoặc đặc thù, bệnh nhân chỉ việc xét nghiệm tìm các mắc-kơ ấy, nếu không có hoặc có nhưng nồng độ quá thấp thì coi như bệnh nhân an toàn hoặc vẫn còn khả năng kiểm soát và điều trị sớm được bệnh. Hoàn hảo trong mô hình lý thuyết lẫn các hướng giải quyết vấn đề, nhưng thực tế gặp nhiều trở ngại là trong cơ thể có hàng chục cơ quan và tới hàng chục mắc-kơ. Vì thế không thể tiến hành cùng một lúc các xét nghiệm hoặc sinh thiết vì giá thành quá đắt và số lượng máu/tế bào lấy ra là quá nhiều. Do vậy thường thì khi nghi ngờ cơ quan nào có dấu hiệu bệnh lý liên quan đến ung thư, bác sĩ mới chỉ định cho bệnh nhân xét nghiệm đặc hiệu cơ quan đó [11].
3.1.2. Phân tách và chọn lọc tế bào bằng từ trường [41,42,44]
Trong y-sinh học, người ta thường xuyên phải tách một loại thực thể sinh học nào đó ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặc cho các mục đích khác như lưu mẫu bệnh phẩm... Phân tách tế bào sử dụng các tác nhân hạt nanô từ tính là một trong những phương pháp thường được sử dụng. Quá trình phân tách được chia làm hai giai đoạn:
+Đánh dấu thực thế sinh học cần nghiên cứu.
+Tách các thực thể được đánh dấu ra khỏi môi trường bằng từ trường ngoài.
Việc đánh dấu được thực hiện thông qua các hạt nanô từ tính. Hạt nanô thường dùng là hạt ô-xít sắt. Các hạt này được bao phủ bởi một lớp vỏ bọc có tính tương hợp sinh học với các thực thể sống được tổng hợp hoặc có nguồn gốc từ thiên nhiên như: dextran, polyvinyl alcohol (PVA),SiO2,... Hóa chất bao phủ không những có thể tạo liên kết với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp cho các hạt nanô phân tán tốt trong dung môi. Giống như trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ được các kháng thể hoặc các phân tử khác như các hoóc-môn, a-xít folic tìm thấy.
Vẫn dựa trên cơ chế tự hợp, liên kết giữa kháng thể - kháng nguyên cùng loại sẽ được hình thành. Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào. Các hạt từ tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch có thể
tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu. Đối với các tế bào lớn, kích thước của các hạt từ tính đôi lúc cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thước vài trăm nanô mét. Quá trình phân tách được thực hiện nhờ một gradient từ trường ngoài. Từ trường ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào được đánh dấu và giữ lại chúng dưới tác dụng của từ lực. Các tế bào không được đánh dấu sẽ không được giữ lại và được “rửa trôi” khỏi hệ phân tách (Hình 4.6). Lực tác động lên hạt từ tính được cho bởi phương trình sau:
F = π.η.R.Δν
Trong đó η là độ nhớt của môi trường xung quanh tế bào (nước), R là bán kính của hạt từ tính, Δν =ν −ν là sự khác biệt về vận tốc giữa tế bào và nước.
Mô hình phân tách tế bào đơn giản nhất được minh họa ở hình 1.41. Hỗn hợp tế bào và chất đánh dấu (hạt từ tính bao phủ bởi một lớp chất hoạt hóa bề mặt) được trộn với nhau để các liên kết hóa học giữa chất đánh dấu và tế bào xảy ra. Sử dụng một từ trường ngoài là một thanh nam châm vĩnh cửu để tạo ra một gradient từ trường giữ các hạt tế bào được đánh dấu lại.
3.2. Ứng dụng bên trong cơ thể “in vivo” 3.2.1. Dẫn truyền thuốc 3.2.1. Dẫn truyền thuốc
Một trong những nhược điểm quan trọng nhất của hóa trị liệu, đó là tính không đặc hiệu. Khi vào trong cơ thể, thuốc chữa bệnh như doxorubicin, epirubicin… thực chất là các loại “độc dược” sẽ phân bố khắp cơ thể và không tập trung vào cơ quan/bộ phận xuất hiện khối u, dẫn các tế bào mạnh khỏe cũng bị ảnh hưởng do tác dụng phụ của thuốc, làm cho bệnh nhân suy giảm sức khỏe và sức đề kháng đồng thời xuất hiện các triệu chứng thường gặp như vàng da, rụng tóc, đắng miệng... Hiện nay, hóa học trị liệu
đang là một phương pháp rất phổ dụng để điều trị bệnh ung thư. Tuy nhiên đây cũng là phương pháp chữa bệnh phân tán và gây rất nhiều tác dụng phụ, do đó trong các bước điều trị ung thư người ta thêm vào công đoạn miễn dịch trị liệu sau khi thực hiện hóa trị liệu để giúp bệnh nhân hồi phục sức khỏe để tiếp tục bước xạ trị hoặc hóa trị [36]. Để thực hiện phương pháp này, trước hết người ta phải tính đến liều lượng mức chịu đựng cho từng bệnh nhân. Điều này có nghĩa là các bệnh nhân có sức khỏe yếu không thể nhận đủ liều lượng để chữa trị dứt điểm các tế bào ung thư trong cơ thể. Trong trường hợp đó, nếu hướng đích được việc vận chuyển thuốc và có biện pháp giữ cho thuốc không bị nhả ra trước khi đến đích không những sẽ làm giảm ảnh hưởng đến các tế bào mạnh mà còn tăng được đủ liều lượng để chữa trị thành công. Chính vì thế việc dùng các hạt từ tính như là hạt mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơ thể (thông thường dùng điều trị các khối u ung thư) đã được nghiên cứu từ những năm 1970, những ứng dụng này được gọi là dẫn truyền thuốc bằng hạt từ tính. Có hai lợi ích cơ bản là:
(i) Thu hẹp phạm vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc.
(ii) Giảm lượng thuốc điều trị.
Hình 1.42. Cơ chế dẫn truyền thuốc nhắm đích nhằm điều trị ung thư trong cơ thể người trên nền tảng vật liệu nanocompostie nhạy cảm nhiệt độ
Gardient từ trường ngoài rất mạnh
Nanocomposite mang thuốc
40-42o
Khối u ung thư
Nâng thân nhiệt
Doxorubicin
Hạt nano Hạt nano tải thuốc
Tế bào đích Thuốc
Vật liệu nanocompostie có tính tương hợp sinh học được gắn kết với thuốc điều trị. Lúc này hạt nano có tác dụng như một hạt mang thuốc. Thông thường hệ thuốc/hạt tạo ra một chất lỏng từ và đi vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn. Khi tiêm các hạt thuốc có kích thước phù hợp với ngưỡng thâm nhập của cơ thể đi vào mạch máu (tĩnh mạch), sau khi đi vào hệ tuần hoàn mà không bị bắt giữ, người ta dùng một gradient từ trường ngoài rất mạnh để tập trung các hạt vào một vị trí nào đó trên cơ thể. Một khi hệ thuốc/hạt được tập trung tại vị trí cần thiết và trải qua các quá trình thực bào và thẩm bào của các đại thực bào thì quá trình nhả thuốc có thể diễn ra thông qua cơ chế hoạt động của các enzym hoặc các tính chất sinh lý học do các tế bào ung thư gây ra như độ pH, quá trình khuyếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt độ (gây sốt nhẹ cục bộ) (Hình 1.42). Quá trình vật lý diễn ra trong việc dẫn truyền thuốc cũng tương tự như trong phân tách tế bào. Gradient từ trường có tác dụng tập trung hệ thuốc/hạt.
Hiệu quả của việc dẫn truyền thuốc phụ thuộc vào cường độ từ trường, gradient từ trường, thể tích và tính chất từ của hạt nano mang thuốc. Thêm vào đó, các chất mang (chất lỏng từ) thường được tiêm vào các tĩnh mạnh hoặc động mạch nên các thông số thủy lực - dược động học như thông lượng máu, nồng độ chất lỏng từ, thời gian tuần hoàn đóng vai trò quan trọng như các thông số sinh lý học như khoảng cách từ vị trí của thuốc đến nguồn từ trường, mức độ liên kết thuốc/hạt, và thể tích của khối u. Các hạt có kích thước micro mét (tạo thành từ những hạt siêu thuận từ có kích thước nhỏ hơn) hoạt động hiệu quả hơn trong hệ thống tuần hoàn đặc biệt là ở các mạch máu lớn và các động mạch.
Nguồn từ trường thường là nam châm NdFeB có thể tạo ra một từ trường khoảng 0,2 T và gradient từ trường khoảng 8 T/m với động mạch đùi và khoảng 100 T/m với động mạch cổ. Điều này cho thấy quá trình dẫn thuốc bằng hạt nano từ tính có hiệu quả ở những vùng máu chảy chậm và gần nguồn từ trường. Tuy nhiên, khi các hạt nano chuyển động ở gần thành mạch máu thì chuyển động của chúng không tuân theo định luật Stoke nên với một gradient từ trường nhỏ hơn quá trình dẫn thuốc vẫn có tác dụng. Các hạt nano từ tính thường dùng là oxít sắt (magnetite Fe3O4, maghemite ∝-Fe2O3) bao phủ xung quanh bởi một hợp chất cao phân tử có tính tương hợp sinh học như PVA,
detran hoặc silica SiO2... Chất bao phủ có tác dụng chức năng hóa bề mặt để có thể liên kết với các phân tử khác như nhóm chức carboxyl, biotin, amino…
Nghiên cứu dẫn truyền thuốc đã được thử nghiệm rất thành công trên động vật, đặc biệt nhất là đã được ứng dụng để điều trị u não. Việc dẫn truyền thuốc đến các u não rất khó khăn vì thuốc cần phải vượt qua “hàng rào” ngăn cách giữa não và máu, nhờ có sự trợ giúp của hạt nano từ có kích thước 10-20 nm, việc dẫn truyền thuốc có hiệu quả