2.3.4.1. Một số phương pháp chế tạo chấm lượng tử bán dẫn lõi
Các chấm lượng tử bán dẫn lõi có thể được chế tạo bằng nhiều phương pháp khác nhau:
a)Phương pháp phản ứng với sự có mặt của chất hoạt động bề mặt (reaction in the presence of surfactants):
Phương pháp này dựa trên sự tính toán, sử dụng các tiền chất (Precusor) để tạo phản ứng trong một môi trường có chứa chất hoạt động bề mặt. Thông thường các tiền chất được chọn để có thể hòa tan trong dung môi phản ứng. Các dung môi có thể là nước (nếu nhiệt độ phản ứng nhỏ dưới 1000C) hoặc dung môi hữu cơ như ODE, TOPO, HDA hoặc diesel (có nhiệt độ sôi đều cao trên 2000C). Ở nhiệt độ phản ứng phù hợp, các tiền chất phản ứng với nhau để hình thành hợp chất bán dẫn muốn chế tạo. Chất hoạt động bề mặt có chức năng như một phần tử điều chỉnh tốc độ phản ứng và tốc độ phát triển
Sự căng tại vùng biên tiếp giáp
C d S V ỏ b ọ c h ữ u c ơ Cd S Bán kính N ă n g l ư ợ n g ( eV ) T h ế n ă n g
tinh thể (liên quan đến điều chỉnh kích thước hạt của vật liệu) và ngăn cản không cho các hạt vi tinh thể kết đám với nhau. Vì vậy trong nhiều trường hợp, chất hoạt động bề mặt còn được gọi là chất ổn định, để điều chỉnh tốc độ tạo mầm vi tinh thể và tốc độ phát triển tinh thể. Do liên kết của chất hoạt động bề mặt với các mặt tinh thể khác nhau là khác nhau, nên theo một khía cạnh khác, chất hoạt động bề mặt còn có ý nghĩa điều chỉnh sự phát triển tinh thể theo các hướng khác nhau, cuối cùng là có thể tạo hình dạng tinh thể nanô khác nhau. Ngoài ra, với khả năng tạo liên kết phân tử với các liên kết hở trên bề mặt chấm lượng tử, chất hoạt động bề mặt còn có tác dụng thụ động hóa các trạng thái bề mặt (các bẫy điện tử) nhằm làm tăng cường độ huỳnh quang của các tinh thể nano.Các chất hoạt động bề mặt thường được sử dụng như: thioglycerol, TG, thioglycolic acid TGA, 3-mercaptopropionic acid MPA, TOPO...
b)Phương pháp micelle và micelle đảo (micelles and reverse micelles):
Micelle và micelle đảo có thể hình dung như những buồng vi phản ứng kích thước nm được tạo thành như các khuôn mềm để phản ứng tạo thành vật liệu kích thước nanomét xảy ra trong đó. Các buồng vi phản ứng/khuôn mềm này được hình thành do tạo được các bọt dầu (chất lỏng hữu cơ không phân cực, kỵ nước) phân tán đều trong môi trường nước (môi trường phân cực) hoặc các bọt nước phân tán đều trong môi trường dầu. Các buồng vi phản ứng dầu trong môi trường nước được gọi là các micelle, trường hợp còn lại nước trong môi trường dầu được gọi là micelle đảo (Hình 1.34). [15,24]
c)Phương pháp chế tạo trong môi trường nước:
Về nguyên tắc, muốn chế tạo các chấm lượng tử, cần tạo điều kiện để các tiền chất phản ứng tạo thành các mầm vi tinh thể càng đồng nhất càng tốt, sau đó chúng phát triển thành tinh thể lớn hơn trong môi trường có đủ các monome của tiền chất để cung cấp cho quá trình phát triển này. Khi tạo mầm vi tinh thể trong môi trường nước, các tiền chất cần được chuẩn bị sẵn ở nhiệt độ không cao, thường là nhiệt độ phòng. Sau đó quá trình phát triển tinh thể nanô cũng ở nhệt độ không quá cao. [26,30]
Các chấm lượng tử bán dẫn sau khi chế tạo xong có thể có các phân tử liên kết trên bề mặt (Các ligand TOPO, MPA…) cho phép thụ động hóa một phần các liên kết hở trên bề mặt tinh thể nanô. Tuy nhiên, các phân tử ligand này liên kết không bền, và trong nhiều trường hợp cần phải loại bỏ khỏi các chấm lượng tử khi sử dụng, nên thường là một loại vật liệu có cấu trúc tương tự, có vùng cấm lớn hơn chấm lượng tử lõi được chế tạo như một lớp áo bên ngoài, có tác dụng trung hòa/thụ động hóa các liên kết hở trên bề mặt chấm lượng tử, làm vật liệu bảo vệ chấm lượng tử lõi khỏi tác động trực tiếp của môi trường và tạo được cấu trúc lượng tử kiểu I để giam hãm hạt tải điện trong chấm lượng tử lõi. Trong nhiều trường hợp, để có được lớp vỏ hoàn hảo giảm thiểu ứng suất với vật liệu lõi, một lớp vỏ trung gian nữa được bổ sung giữa các chấm lượng tử lõi và lớp vỏ ngoài cùng, tạo thành cấu trúc lõi/vỏ/vỏ. Việc giảm thiểu ứng suất có ý nghĩa làm cho vật liệu ổn định và bền hơn, có tính chất quang tốt hơn.
Nguyên lý chế tạo lớp vật liệu vỏ là quá trình epitaxy dần dần vật liệu vỏ trên bề mặt của tinh thể chấm lượng tử lõi. Do đó nguồn cung cấp tiền chất cho vật liệu vỏ phải được bổ sung từ từ (để tránh tạo thành pha vật liệu riêng, tách biệt khỏi vật liệu lõi). Các hợp chất của tiền chất phải được phân hủy ở nhiệt độ tạo vỏ, để giải phóng monome tương ứng cho vật liệu vỏ. Hơn nữa, để việc tạo lớp vật liệu vỏ không ảnh hưởng tới kích thước của chấm lượng tử lõi, thường nhiệt độ tạo lớp vật liệu vỏ phải nhỏ hơn nhiệt độ đã chế tạo chấm lượng tử lõi. ZnS và CdS là vật liệu chế tạo lớp vỏ phổ biến cho các loại chấm lượng tử CdSe, CdTe, InP, CuInS2. Lớp vỏ CdS hoặc ZnSe cũng thường được làm trung gian cho vỏ ZnS để tạo cấu trúc vỏ kép cho chấm lượng tử CdSe (CdSe/CdS/ZnS) với hiệu suất huỳnh quang tốt hơn nhiều so với cấu trúc đơn lớp vỏ.
3. Định hướng ứng dụng của vật liệu nanocomposite (Fe3O4-CdSe/CdS) với lớp phủ polymer nhạy cảm với nhiệt độ trong y-sinh học: phủ polymer nhạy cảm với nhiệt độ trong y-sinh học:
3.1. Ứng dụng ngoài cơ thể “in vitro” 3.1.1 Chẩn đoán và xét nghiệm bệnh 3.1.1 Chẩn đoán và xét nghiệm bệnh
Nguyên lý phát hiện tế bào bệnh và các vi khuẩn dựa trên phương pháp ELISA. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA là là một kỹ thuật sinh hóa dựa vào cơ chế tự hợp đặc hiệu (tự ghép cặp) giữa kháng nguyên - kháng thể và để phát
hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học.
Hình 1.36. Phương pháp ELISA trong xét nghiệm y-sinh học
Nguyên lý của ELISA gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên (Antigen) chưa biết được gắn trên một bề mặt;
(2) Kháng thể (antibody) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme
(3) Thêm vào một cơ chất (Substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Với ELISA phát quang, ánh sáng được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên-kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên-kháng thể sẽ quyết định cường độ cũng như màu sắc ánh sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate), gồm 2 phương pháp: -Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên được gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa.
-Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra.
Sau đó, kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên- kháng thể có thể xảy ra.
Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng nguyên thứ cấp (secondary antigen) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng nguyên thứ cấp này.. Sau khi tạo được phức hợp kháng thể đặc hiệu, tiến hành kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn đích. Có nhiều cách phát hiện vi khuẩn đích như:
-Quan sát và đếm trực tiếp các tế bào vi khuẩn phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang.
-Xác định số lượng vi khuẩn đích bằng đường chuẩn giữa cường độ phát quang của vi khuẩn gắn “thuốc thử” và số lượng vi khuẩn trong dung dịch chuẩn. Cường độ phát huỳnh quang là hàm số f của số lượng tế bào vi khuẩn đích trong mẫu.
Hình 1.37. Quan sát các mẫu bệnh phẩm dưới kính hiển vi huỳnh quang
Trước đây các cơ chất tạo màu sắc (các chất màu hữu cơ) được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Vật liệu nanocomposit (SPION-QD) (Fe3O4-CdSe/CdS) với lớp phủ polymer chế tạo thành công trong luận văn này với thành phần chấm lượng tử cấu trúc lõi/vỏ CdSe/CdS có hiệu suất huỳnh quang khá cao hứa hẹn sẽ làm tăng tính
đặc hiệu, độ chính xác cho việc phát hiện và đánh dấu tế bào bệnh, cũng như các loại vi khuẩn. Thực nghiệm đã chứng minh được càng nhiều cầu nối trung gian giữa kháng thể và hạt nano chứa tâm màu phát quang càng làm cho phức hợp bền vững hơn và kháng thể không mất hoạt tính lâu hơn. Vỏ bọc polymer Poly(Glycidyl methacrylate) có diện tích bề mặt lớn hơn, hoạt hóa biến tính bề mặt để tạo nhóm chức amino NH2- nhằm đính với kháng nguyên/kháng thể dễ dàng hơn, số lượng cầu nối trung gian giữa các kháng thể trên bề mặt với chấm lượng tử cấu trúc lõi vỏ CdSe/CdS nhiều hơn so với vật liệu SiO2 được nghiên cứu trước đây.
Hình 1.38 là ảnh TEM và SEM của vi khuẩn Ecoli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp kháng thể + hạt nano silica SiO2 được thực hiện trong một công trình nghiên cứu trong nước [32], bước đầu đã chế tạo thành công phức hợp kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích được bao bọc bằng hạt nano silica SiO2 bằng cách gắn trực tiếp các phân tử kháng thể lên bề mặt hạt silica thông qua liên kết amine–carboxylic với sự có mặt của chất xúc tác EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) trong các điều kiện sau: EDAC/1 phản ứng là 0,9mg; tỉ lệ kháng thể với hạt silica là 40/1; thời gian phản ứng hợp sinh 3 giờ có lắc ngang, nhiệt độ ủ ở 300C.
Hình 1.38. Ảnh TEM và SEM của vi khuẩn Ecoli O157:H7 được bao bọc bởiphức hợp kháng thể + hạt nano silica SiO2 [11]
Phức hợp kháng thể và hạt silica được tạo thành này có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích E. coli O157:H7 trong vòng 20 phút, tỉ lệ vi khuẩn đích gắn phức hợp và phát quang đạt > 60% và sau 3 ngày vẫn phức hợp vẫn giữ nguyên hoạt tính. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật này đối vối vi khuẩn đích là 102 CFU/ml, thời gian phát hiện nhanh hơn các phương pháp thông thường nhiều lần. Ảnh TEM và SEM
của tế bào E.coli O157:H7 được đánh dấu bởi phức hợp kháng thể + hạt nano silica đã chứng minh rằng phức hợp này có thể bao bọc đều hoàn toàn và như nhau lên bề mặt tế bào vi khuẩn. Qua đó có thể khẳng định các hạt nano silica hợp sinh với kháng thể vẫn giữ nguyên tính chất phát quang hiệu quả và các phân tử kháng thể khi gắn với hạt nano silica vẫn giữ được hoạt tính và có khả năng nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích.
Hình 1.39.Ảnh huỳnh quang: (a) phức hợp hạt nano silica – kháng thể; (b) Vi khuẩn gắn với phức hợp kháng thể - Silica; (c) Vi khuẩn gắn với phức hợp kháng thể - QDs
Hình 1.40. Phổ huỳnh quang của phức hợp hạt silica – kháng thể gắn kết với vi khuẩn E.coli O157:H7 [11]
Hình 1.40 chính là cơ sở để xây dựng đường chuẩn: cường độ phổ - số lượng E.coli O157:H7giúp phát hiện nhanh, nhạy số lượng vi khuẩn ở mật độ thấp. Trong xét nghiệm và chẩn đoán các loại bệnh ung thư, mỗi loại ung thư đều có một đặc điểm nhận dạng sinh học riêng mà thuật ngữ y học gọi là các mắc-kơ ung thư (marker). Các mắc-kơ này có đặc điểm là xuất hiện trong máu và với nồng độ cao khi khối u ung thư xuất hiện nên
nó rất có giá trị trong việc chẩn đoán ung thư. Một số mắc-kơ điển hình như PSA chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt, AFP giúp chẩn đoán ung thư gan, CA giúp chẩn đoán ung thư vú, CEA giúp chẩn đoán ung thư buồng trứng. Do đó, mỗi khi nghi ngờ bị ung thư một cơ quan nào đó với các biểu hiện lâm sàng chung hoặc đặc thù, bệnh nhân chỉ việc xét nghiệm tìm các mắc-kơ ấy, nếu không có hoặc có nhưng nồng độ quá thấp thì coi như bệnh nhân an toàn hoặc vẫn còn khả năng kiểm soát và điều trị sớm được bệnh. Hoàn hảo trong mô hình lý thuyết lẫn các hướng giải quyết vấn đề, nhưng thực tế gặp nhiều trở ngại là trong cơ thể có hàng chục cơ quan và tới hàng chục mắc-kơ. Vì thế không thể tiến hành cùng một lúc các xét nghiệm hoặc sinh thiết vì giá thành quá đắt và số lượng máu/tế bào lấy ra là quá nhiều. Do vậy thường thì khi nghi ngờ cơ quan nào có dấu hiệu bệnh lý liên quan đến ung thư, bác sĩ mới chỉ định cho bệnh nhân xét nghiệm đặc hiệu cơ quan đó [11].
3.1.2. Phân tách và chọn lọc tế bào bằng từ trường [41,42,44]
Trong y-sinh học, người ta thường xuyên phải tách một loại thực thể sinh học nào đó ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặc cho các mục đích khác như lưu mẫu bệnh phẩm... Phân tách tế bào sử dụng các tác nhân hạt nanô từ tính là một trong những phương pháp thường được sử dụng. Quá trình phân tách được chia làm hai giai đoạn:
+Đánh dấu thực thế sinh học cần nghiên cứu.
+Tách các thực thể được đánh dấu ra khỏi môi trường bằng từ trường ngoài.
Việc đánh dấu được thực hiện thông qua các hạt nanô từ tính. Hạt nanô thường dùng là hạt ô-xít sắt. Các hạt này được bao phủ bởi một lớp vỏ bọc có tính tương hợp sinh học với các thực thể sống được tổng hợp hoặc có nguồn gốc từ thiên nhiên như: dextran, polyvinyl alcohol (PVA),SiO2,... Hóa chất bao phủ không những có thể tạo liên kết với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp cho các hạt nanô phân tán tốt trong dung môi. Giống như trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ được các kháng thể hoặc các phân tử khác như các hoóc-môn, a-xít folic tìm thấy.
Vẫn dựa trên cơ chế tự hợp, liên kết giữa kháng thể - kháng nguyên cùng loại sẽ được hình thành. Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào. Các hạt từ tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch có thể
tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu. Đối với các tế bào lớn, kích thước của các hạt từ tính đôi lúc cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thước vài trăm nanô mét. Quá trình phân tách được thực hiện nhờ một gradient từ trường ngoài. Từ trường ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào được đánh dấu và giữ lại chúng dưới tác dụng của từ lực. Các tế bào không được đánh dấu sẽ không được giữ lại và được “rửa trôi” khỏi hệ phân tách (Hình 4.6). Lực tác động lên hạt từ tính được cho bởi phương trình sau:
F = π.η.R.Δν
Trong đó η là độ nhớt của môi trường xung quanh tế bào (nước), R là bán kính của hạt từ tính, Δν =ν −ν là sự khác biệt về vận tốc giữa tế bào và nước.
Mô hình phân tách tế bào đơn giản nhất được minh họa ở hình 1.41. Hỗn hợp tế bào và chất đánh dấu (hạt từ tính bao phủ bởi một lớp chất hoạt hóa bề mặt) được trộn với nhau để các liên kết hóa học giữa chất đánh dấu và tế bào xảy ra. Sử dụng một từ