II. TỔ CHỨC DẠY HỌC CHUYÊN ĐỀ:
2. Sinh sản bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3. Nguyên tắc nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô bao gồm việc nuôi cấy các mô cách li, các tế bào riêng biệt, các lạp thể cách li, các hạt phấn và các cơ quan thực vật.
2.3.1. Nuôi cấy mô thực vật
Khả năng của tế bào có thể phân hoá hoặc mất phân hoá chuyển sang phân chia. Quá trình phân hoá được bắt đầu từ sự phân huỷ các bào quan chuyển hoá
(lục lạp, sắc lạp). Cấu trúc tế bào gia tăng những biến đổi và phát triển mạng lưới nội chất, tăng số lượng ribôsôm tăng quá trình tổng hợp ARN, protêin có nghĩa là toàn bộ cấu trúc tế bào trở nên gần giống với tế bào mô phân sinh.
Sự xuất hiện và hình thành protein mới chứng tỏ trong sự phân hoá hoạt tính của bộ gen có thay đổi. Vai trò của các phytohoocmôn (auxin và xitokinin), sự phân chia tế bào đã loại bỏ sự phân hoá dẫn đến hình thành mô sẹo (callus).
Sau khi hình thành mô sẹo trong các điều kiện và thành phần dinh dưỡng xác định bắt đầu quá trình phân hoá thứ sinh (là sự phân hoá mô) tạo nên cơ thể mới. Trong quá trình phát triển tế bào không mất lượng thông tin di truyền mà chỉ mất khả năng biểu hiện thông tin đó. Như vậy là mỗi tế bào thực vật chứa một lượng thông tin di truyền toàn vẹn
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thực hiện đối với rễ cách li (lúa mì, ngô, cà chua, đậu Hà Lan) được tiến hành trong các bình chứa dung dịch dinh dưỡng đến 1/3 bình. Dung dịch dinh dưỡng gồm muối khoáng, xacarozơ hay glucôzơ, tiamin.
Hình 5. Nuôi cấy rễ
Các đỉnh rễ dài 1cm của cây non đang nảy mầm đặt lên trên bề mặt củ dung dịch. Sau 10 ngày đã có nhiều rễ tóc đủ để cấy tiếp. (hình 5)
Đối với đỉnh thân: Thực hiện khó hơn, phải bổ sung xitokinin và giberelin.
Điều lí thú là cây được tái sinh hoàn toàn nguyên vẹn từ các đỉnh sinh trưởng của rễ và thân là không bị nhiễm virut.
Ngay cả trong trường hợp cây đã bị nhiễm virut (thược dược, khoai tây, lan – thí nghiệm của Morel và Martin 1954, 1963) cũng có thể tái sinh các dòng sạch bệnh.
Nuôi cấy mô của cơ quan tách rời từ các củ (cà rốt), thân hay cuống lá (nho), cành non vào thời điểm dâng nhựa (liễu): Dùng môi trường dinh dưỡng
thạch trắng (thạch trắng 1%, glucôzơ 3%, muối khoáng, AIA 3.10-8 g/ml). Thường cấy chuyền hai tháng một lần (hình 7, 8, 9).
Từ các cây sạch bệnh đem nuôi mô trong môi trường thạch sau một thời gian sẽ tạo thành cây con. Sau đó đem nhân cây con ra đồng ruộng.
Nhận xét:
-Nuôi cấy mô bằng nuôi cấy cơ quan đã tạo nên hàng loạt các cá thể vẫn giữ nguyên tính trạng của cây mẹ. Sự tái sinh cây nguyên vẹn từ nuôi cấy tế bào hay sử dụng mô callus để tạo ra những cá thể thích hợp nhưng ít được sử dụng để tạo ra các dòng xoma. Ngược lại, nuôi cấy mô phân sinh đỉnh đạt kết quả rõ ngay từ đầu (VD ở cây phong lan, cẩm chướng, hoa hồng, phúc bồn tử,...).
Ví dụ các mô phân sinh đỉnh của phong lan có đặc tính sản sinh ra một cách tự nhiên các phôi xôma. Tiến hành tách và cấy chuyển trên môi trường mới sẽ tạo ra gần 1 triệu “cây ống nghiệm” trong 10 tháng. Từ một mô phân sinh tách từ đỉnh cây cẩm chướng với 4 lóng cành giấm sản sinh 50.000 cây ống nghiệm so với phương pháp thông thường chỉ đạt 50 cây con.
-Trong nuôi cấy mô phân sinh việc xác định một tỉ lệ giữa xitokinin và auxin là cốt yếu, dẫn đến sự phân hoá rễ (vai trò auxin) và chồi (vai trò xitôkinin) (hình 3)
-Những mảnh mô nuôi cấy được tách rời từ những cơ quan khác nhau cũng cho phép tái sinh thành cây nguyên vẹn. Ví dụ cụm hoa (tỏi tây, súp lơ), lá (thu hải đường, rau diếp xoăn...)
-Nuôi cấy các mảnh từ lá hay từ phôi lá đã được tiến hành để nhân giống cà phê, cọ dầu.
Nuôi cấy mô sẹo từ hạt phấn: Vào khoảng 1965, việc nuôi cấy bao phấn đã thành công, hạt phấn đã chín, tiếptheo sự phân hoá dẫn đến hình thành cây đơn bội và được gọi là đơn bội lưỡng bội hoá do sự tái sinh cơ thể thực vật từ nuôi cấy hạt phấn đơn tính đực hay từ mảnh của túi phôi.
Những cây tái sinh là đơn bội sẽ bị loại bỏ vì nó luôn ở trạng thái bất thụ. Chỉ cây nào có bộ nhiễm sắc thể đa bội mới thụ tinh (thường xử lí bằng conxixin để có cá thể đa bội). Các cá thể thu được là “cá thể đơn bội kép”. ở cá thể đơn
bội kép các tính trạng lặn không bị che lấp bởi lưỡng bội nên có lợi cho phân tích di truyền.
2.3.2. Nguyên tắc nuôi cấy mô - tế bào thực vật bằng tế bào trần
Dung hợp là khả năng sử dụng protoplast (tế bào trần) làm nguyên liệu lí tưởng trong nghiên cứu các vấn đề sinh học hiện đại: mọi tế bào thực vật đèu được bao bọc xung quanh bởi một thành tế bào bằng xenlulozơ nên tế bào có hình dạng nhất định.
Ví dụ: tế bào thực vật trong các mô thường có 14 mặt (8mặt hình 6 cạnh và 6 mặt hình 4 cạnh). Nếu phá vỡ thành tế bào bằng enzim (xenlulaza + proteinaza) và tác nhân gây co nguyên sinh (manitol) thì toàn bộ các chất bên trong sẽ thoát ra, tạo thành một khối hình cầu, bên ngoài bao bằng một màng mỏng, đàn hồi gọi là màng tế bào chất. Khối hình cầu này được gọi là tế bào trần
Ngày nay người ta có thể nuôi dễ dàng các tế bào tràn này trên các môi trường nhân tạo (dịch thể). Chúng có thể tăng kích thước đến một mức độ nào đó rồi phân chia thành các tế bào trần mới.
Đáng chú ý là khi đưa hai loại tế bào trần lại gần nhau, các loại tế bào trần này có thể trộn lẫn với nhau để tạo thành một tế bào trần mới, có kích thước lớn hơn và mang đặc tính di truyền của hai loại tế bào này. Đó là quá trình dung hợp tế bào trần. Tế bào lai được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng sẽ tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào con, cháu của thế hệ sau. Các tế bào này khi nuôi cấy trên môi trường thạch, với điều kiện thích hợp có thể tái tạo ra những cây hoàn chỉnh.
Nếu lai một tế bào trần có nhân bất hoạt (thể cho) với một tế bào trần bình thường (thể nhận) có thể tạo thành thế hệ tế bào lai không mang nhân của tế bào cho, nhưng vẫn có thể mang các đặc tính của lục lạp, ti thể... tế bào cho (nhờ các gen tế bào chất của thể cho vẫn tồn tại trong tế bao dung hợp). Từ đó có thể chuyển gen chống chịu với thuốc diệt cỏ với thuốc kháng sinh, gen kháng nấm bệnh, chống virut, gen bất thụ... vào tế bào nhân.
Phương pháp lai tế bào trần còn gọi là lai tế bào xôma được dùng rộng rãi trong di truyền chọn giống cây trồng.
Các nhà khoa học đã thực hiện việc chuyển trên 100 gen khác nhau giữa các loài thực vật (kế cả các loài có quan hệ xa nhau) và chuyển gen của vi khuẩn vào tế bào thực vật để tạo ra những cây trồng có khả năng tự diệt sâu bọ phá hoại.
Hiện có 3 phương pháp thường dùng:
•Phương pháp Cocking dùng NaNO3 0,25M để kích thích dung hợp
•Phương pháp Keller và Melchers dùng pH cao và nồng độ CaH cao (pH = 10,5)
•Phương pháp Kao và Gambẻg dùng polietilengicol (PEG)